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  間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因其多向分化潛能，被廣泛應(yīng)用于骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。當(dāng)前主流的成骨誘導(dǎo)策略，普遍依賴骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）、地塞米松等外源成骨因子配合特定培養(yǎng)基，但此類方法存在成本高、副作用強(qiáng)、體內(nèi)效應(yīng)不穩(wěn)定等難題，嚴(yán)重制約了其臨床轉(zhuǎn)化。如何在無外源誘導(dǎo)因子參與的條件下，實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的成骨分化，成為干細(xì)胞應(yīng)用研究的一大挑戰(zhàn)。

  近日，華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院朱偉教授團(tuán)隊(duì)與廣東省人民醫(yī)院陳洪林副教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合，提出了一種全新的“界面硅化（Interfacial Silicification）”策略：通過人工設(shè)計(jì)的兩親性肽分子，在細(xì)胞膜表面原位催化硅前驅(qū)體沉積，直接誘導(dǎo)MSC分化為成骨細(xì)胞。該策略不僅完全擺脫了傳統(tǒng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的依賴，更在多種來源的MSC中展現(xiàn)出穩(wěn)定、通用的誘導(dǎo)效果。相關(guān)成果以“Interfacial Silicification Efficiently Drives Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Any Exogenous Osteoinductive Factor”為題，發(fā)表在國際頂級(jí)期刊《ACS Nano》上。

圖1. CPR肽驅(qū)動(dòng)的界面硅化誘導(dǎo)MSC成骨分化示意圖。a）CPR肽嵌入MSC細(xì)胞膜，通過親疏水協(xié)同作用促使硅前驅(qū)體在細(xì)胞表面聚集并沉積；b）在無外源成骨誘導(dǎo)因子的條件下，經(jīng)界面硅化處理后的MSC成功誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。

  為實(shí)現(xiàn)無因子驅(qū)動(dòng)的成骨誘導(dǎo)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)出一種功能性兩親性多肽（CPR肽），其包含三個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域：N端棕櫚酸鏈用于錨定細(xì)胞膜、中央PEG間隔臂提升親水性與生物相容性，C端則引入源于硅藻肽的RRIL序列，具備高度親硅活性。該肽可自組裝插入MSC細(xì)胞膜，通過調(diào)控細(xì)胞界面與硅前驅(qū)體（如TEOS水解產(chǎn)物Si(OH)?）的動(dòng)態(tài)交換，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜原位硅沉積。

  這一“界面硅化”過程有效改變了MSC的表面微環(huán)境，并引發(fā)一系列信號(hào)傳導(dǎo)變化，包括成骨相關(guān)因子（RUNX2、OPN、OCN等）的顯著上調(diào)，最終促進(jìn)MSC向成骨細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。更重要的是，這一過程完全無需傳統(tǒng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液，展現(xiàn)出優(yōu)異的通用性與操作簡便性。

圖2. CPR功能肽的合成與結(jié)構(gòu)表征。a）CPR肽的合成流程圖；b）ESI質(zhì)譜驗(yàn)證了肽鏈分子量的準(zhǔn)確性；c）圓二色譜揭示其在疏水環(huán)境中趨向形成α-螺旋構(gòu)象；d）通過熒光探針法測(cè)定其CMC為78.27 mg/L，顯示其良好的自組裝能力。

  為了實(shí)現(xiàn)“界面催化沉積”的設(shè)計(jì)構(gòu)想，研究團(tuán)隊(duì)采用固相合成策略構(gòu)建了CPR肽分子，其結(jié)構(gòu)包括棕櫚酸疏水基、PEG?親水間隔段和具有強(qiáng)硅親和力的RRIL功能序列。通過質(zhì)譜檢測(cè)（ESI-MS），驗(yàn)證了合成肽的分子量準(zhǔn)確、結(jié)構(gòu)純凈；圓二色譜（CD）進(jìn)一步揭示其在水相中呈現(xiàn)無序構(gòu)象，而在疏水環(huán)境中誘導(dǎo)α-螺旋結(jié)構(gòu)的形成，模擬了其在細(xì)胞膜嵌入狀態(tài)下的構(gòu)象轉(zhuǎn)變。

  此外，熒光探針和CMC（臨界膠束濃度）測(cè)試顯示，CPR肽具備良好的自組裝能力，可穩(wěn)定聚集于膜表面，形成有序排列，為硅前驅(qū)體的吸附與聚合提供理想的催化微環(huán)境。這些結(jié)果共同驗(yàn)證了該功能肽在界面硅化策略中的關(guān)鍵作用。

圖3. 界面硅化后MSC表面結(jié)構(gòu)及力學(xué)性能變化。a–b）SEM展示了MSC與硅化后細(xì)胞表面的結(jié)構(gòu)對(duì)比，硅化組（1:20）呈現(xiàn)明顯顆粒沉積；c）共聚焦顯微鏡顯示TEOS沉積隨CPR濃度增強(qiáng)而累積（綠色熒光）；d）AFM熱圖揭示硅化處理后細(xì)胞局部剛度與黏附力均顯著升高。

  為了驗(yàn)證CPR誘導(dǎo)的“界面硅化”是否真實(shí)發(fā)生于細(xì)胞表面，研究團(tuán)隊(duì)使用掃描電子顯微鏡（SEM）和原子力顯微鏡（AFM）對(duì)MSC進(jìn)行形貌與力學(xué)表征。未處理細(xì)胞表面光滑，而硅化處理后細(xì)胞表面出現(xiàn)粗糙顆粒狀結(jié)構(gòu)，明確提示有無機(jī)殼層沉積。AFM測(cè)定也顯示，硅化細(xì)胞的楊氏模量和黏附力均明顯上升，表明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化。

  進(jìn)一步借助FITC標(biāo)記的硅前驅(qū)體染色和熒光顯微鏡觀察，不同CPR/TEOS比例組中均觀察到綠色熒光增強(qiáng)，且1:20與1:30組最強(qiáng)，說明在最佳比例下，CPR能顯著促進(jìn)硅在細(xì)胞表面的聚集沉積。

  這些結(jié)果不僅直觀展示了“界面硅化”的發(fā)生過程，也揭示其對(duì)細(xì)胞表面生物力學(xué)特性（剛度、附著力等）的影響，為后續(xù)成骨分化的發(fā)生提供了結(jié)構(gòu)和物理基礎(chǔ)。

圖4. 界面硅化顯著促進(jìn)MSC成骨分化。a–b）ALP染色與活性定量結(jié)果顯示，CPR+TEOS處理組在無誘導(dǎo)因子的BM條件下仍表現(xiàn)出顯著成骨啟動(dòng)能力；c–d）茜素紅染色及定量結(jié)果揭示礦化水平同步提升；e–f）免疫熒光顯示RUNX2、OPN與OCN表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞向成骨方向分化。

  為了驗(yàn)證界面硅化策略在生物功能層面的實(shí)際成效，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)MSC成骨分化的全過程進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。在未添加任何外源成骨因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)條件（Basal Medium, BM）下，CPR+TEOS處理組在第7天即顯示出顯著的堿性磷酸酶（ALP）活性增強(qiáng)，尤其是1:20配比組染色最深，活性提升近兩倍，顯示出優(yōu)異的早期成骨潛能。

  在礦化階段，茜素紅染色結(jié)果（第21天和第28天）顯示1:20組鈣鹽沉積最為顯著，呈現(xiàn)大面積紅色結(jié)晶，反映了后期骨基質(zhì)形成能力的增強(qiáng)。進(jìn)一步的免疫熒光染色與RT-qPCR分析也表明：成骨相關(guān)蛋白（RUNX2、OPN、OCN）表達(dá)顯著上調(diào)，且分布呈特異性核/胞定位，印證了MSC在界面硅化引導(dǎo)下成功進(jìn)入成骨分化通路。

  值得注意的是，這一效應(yīng)在無任何成骨培養(yǎng)基的條件下依然穩(wěn)健存在，且多種來源MSC（包括hBMSC和hUMSC）均可復(fù)現(xiàn)這一分化趨勢(shì)，凸顯其廣泛的適應(yīng)性與轉(zhuǎn)化潛力。

  以上相關(guān)成果以“Interfacial Silicification Efficiently Drives Osteogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells without Any Exogenous Osteoinductive Factor”為題，發(fā)表于國際權(quán)威期刊《ACS Nano》上。

  本研究首創(chuàng)性地提出了一種無需任何外源誘導(dǎo)因子的干細(xì)胞成骨分化策略——界面硅化（Interfacial Silicification），通過設(shè)計(jì)一類功能性兩親肽，在MSC細(xì)胞膜表面引導(dǎo)硅前驅(qū)體原位聚合沉積，顯著增強(qiáng)細(xì)胞黏附性、機(jī)械強(qiáng)度與骨向分化能力。該方法在鼠源、人骨髓及臍帶MSC中均表現(xiàn)出穩(wěn)定誘導(dǎo)效果，具備廣泛的適用性與轉(zhuǎn)化潛力。

  相比傳統(tǒng)依賴培養(yǎng)基與生長因子的成骨誘導(dǎo)方式，界面硅化策略不僅降低了操作復(fù)雜度與成本，更顯著提升了安全性與可控性，為未來無因子細(xì)胞工程與骨組織再生技術(shù)的發(fā)展提供了全新思路。

  該論文第一作者為華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生田周萍，通訊作者為華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院朱偉教授和廣東省人民醫(yī)院陳洪林副教授。

  該研究得到了國家自然科學(xué)基金、廣東省珠江人才計(jì)劃、廣東省引進(jìn)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)計(jì)劃、廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目的支持。

  原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsnano.5c01628