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  惡性黑色素瘤作為最具侵襲性的皮膚惡性腫瘤之一，其傳統(tǒng)治療手段臨床療效往往有限。化學(xué)動(dòng)力學(xué)療法（CDT）因其優(yōu)異的腫瘤選擇性和低毒性而備受關(guān)注，但單一療法效果受限，主要?dú)w因于復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境中過表達(dá)谷胱甘肽（GSH）、酸性pH及缺氧誘導(dǎo)的免疫抑制。因此，迫切需要開發(fā)能整合化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療與其他治療策略的多功能納米平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)成像與高效特異性治療。

  CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)能夠特異性敲除PD-L1基因，從而永久性阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點(diǎn)通路，從根本上抑制腫瘤的免疫逃逸。基于上述特性，該技術(shù)對(duì)免疫原性極強(qiáng)的黑色素瘤尤為使用。然而，腫瘤微環(huán)境（TME）的復(fù)雜病理特征，尤其是免疫抑制分子腺苷（ADO）的過度積累，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的療效。在缺氧的TME中，CD39/CD73可將促炎性ATP代謝為ADO，顯著抑制免疫細(xì)胞功能。研究表明，改善腫瘤缺氧狀態(tài)可有效下調(diào)CD39/CD73表達(dá)，進(jìn)而阻斷ADO介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)。

  基于此，東華大學(xué)郭睿教授/史向陽教授課團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種基于MnO₂納米顆粒與CRISPR/Cas9-PD-L1基因編輯系統(tǒng)共遞送的仿生納米平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療與免疫治療的聯(lián)合治療（圖1）。研究團(tuán)隊(duì)利用PEG修飾的PEI穩(wěn)定MnO₂形成PEI-PEG@MnO₂（PPM）載體，隨后通過靜電吸附負(fù)載CRISPR/Cas9-PD-L1構(gòu)建PPMC復(fù)合物，最后包覆B16-F10癌細(xì)胞膜形成PPMC@CM仿生納米顆粒。癌細(xì)胞膜仿生包被將賦予納米顆粒同源靶向特性和免疫逃逸功能，顯著提升了納米顆粒的遞送效率和腫瘤特異性富集能力。PPMC@CM進(jìn)入細(xì)胞后，觸發(fā)溶酶體逃逸釋放CRISPR/Cas9-PD-L1，高效敲除PD-L1基因。此外，釋放的MnO₂緩解腫瘤缺氧，阻斷缺氧-腺苷免疫抑制通路，同時(shí)消耗腫瘤微環(huán)境中過量GSH以增強(qiáng)Mn²⁺介導(dǎo)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果，并實(shí)現(xiàn)腫瘤特異性T₁加權(quán)MRI成像。PPMC@CM通過聯(lián)合化學(xué)動(dòng)力學(xué)-免疫治療抑制腫瘤生長(zhǎng)并實(shí)現(xiàn)MRI監(jiān)測(cè)，為黑色素瘤的診療一體化提供了創(chuàng)新性策略。

圖1. PPMC@CM的合成路線及其用于MRI引導(dǎo)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)/免疫治療的機(jī)制示意圖。

  TEM和XPS結(jié)果證實(shí)PPM的成功合成，平均粒徑為20.62 nm（圖2A-C）。瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)N/P比≥0.5時(shí)，PPM能夠完全壓縮Cas9-PD-L1（圖2D）。綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，PPMC可以有效轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，并且最佳N/P為15（圖2E-G）。SDS-PAGE和TEM結(jié)果顯示B16-F10細(xì)胞膜成功包覆，PPMC@CM的平均粒徑為158.9 nm，細(xì)胞膜厚度約為12.2 nm（圖2H-I）。

圖2.（A）PPM的TEM圖像及（B）粒徑分布直方圖。（C）PPM中Mn 2p軌道的XPS能譜。（D）不同N/P下Cas9-PD-L1與PPM的瓊脂糖凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)。泳道1：DNA Marker（100-5000 bp）；泳道2：游離Cas9-PD-L1；泳道3-7：N/P分別為0.125、0.25、0.5、1和2。（E）通過共聚焦顯微鏡觀察B16-F10細(xì)胞經(jīng)PBS、pDNA及PPMC（N/P = 5、10、15和20）轉(zhuǎn)染后的綠色熒光蛋白表達(dá)（比例尺：20 μM）。（F）B16-F10細(xì)胞經(jīng)PBS、pDNA及PPMC（N/P = 5、10、15和20）轉(zhuǎn)染后的流式細(xì)胞術(shù)圖及（G）相對(duì)定量結(jié)果。（H）PPMC@CM的SDS-PAGE結(jié)果分析。（I）PPMC@CM的TEM圖像。

  研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)評(píng)估了材料的·OH/O₂生成能力及MR成像性能。MB降解實(shí)驗(yàn)表明，PPM在模擬TME條件下展現(xiàn)出優(yōu)異的·OH生成性能（圖3A）。PPMC@CM能有效催化H₂O₂分解產(chǎn)氧（圖3B），并實(shí)現(xiàn)Mn²⁺的響應(yīng)性釋放（圖3C）。核磁共振分析證實(shí)，該材料具有GSH響應(yīng)特性，可釋放Mn²⁺用于T₁加權(quán)MR成像（圖3C-D）。此外，PPMC@CM表現(xiàn)出良好的血液相容性（圖3F），證實(shí)其具備安全可靠的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用潛力，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

圖3.（A）PPM在不同條件下與MB 反應(yīng)后的UV-vis譜圖（[MB] = 10 μg/mL，[NaHCO₃] = 25 mM，[H₂O₂] = 10 mM，[Mn] = 0.1mM）。（B）不同濃度材料分散體系中H₂O₂分解的O₂濃度隨時(shí)間變化曲線（[H₂O₂] = 10 mM）。（C）PPMC@CM在不同Mn濃度及GSH（10 mM）存在與否條件下的偽彩色磁共振成像圖和（D）1/T₁值與Mn濃度之間的線性擬合關(guān)系。（E）PPMC@CM在不同環(huán)境條件下Mn²⁺的累積釋放動(dòng)力學(xué)曲線。（F）CPL@G5-BS在有無激光照射下652 nm處的紫外吸收強(qiáng)度對(duì)比。

  研究團(tuán)隊(duì)選用B16-F10細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。細(xì)胞毒性分析表明，PPMC@CM具有最優(yōu)的腫瘤細(xì)胞殺傷效果（圖4A）。細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)證實(shí)CM包覆顯著增強(qiáng)了材料的靶向攝取能力并賦予其免疫逃逸特性（圖4B-D）。通過溶酶體共定位及Western blot分析發(fā)現(xiàn)，PPMC@CM在4小時(shí)內(nèi)被內(nèi)化進(jìn)入溶酶體，8小時(shí)后成功逃逸并進(jìn)入細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)PD-L1基因敲除（圖4E-G）。

圖4.（A）不同材料對(duì)B16-F10細(xì)胞的細(xì)胞毒性評(píng)估。（B）B16-F10細(xì)胞或RAW264.7細(xì)胞與不同材料共孵育后細(xì)胞內(nèi)的Mn含量。（C）B16-F10細(xì)胞與不同材料共孵育6小時(shí)后的流式細(xì)胞術(shù)分析圖及（D）平均熒光強(qiáng)度的。（E）PPMC@CM（Cy3標(biāo)記Cas9-PD-L1）與B16-F10細(xì)胞共孵育2、4、8小時(shí)的共聚焦顯微鏡圖像及（F）相應(yīng)的共定位熒光強(qiáng)度分析。比例尺: 10 μm。（G）Western blot檢測(cè)與不同材料共孵育后細(xì)胞PD-L1蛋白的表達(dá)水平及相應(yīng)的定量分析結(jié)果。

  接下來，研究團(tuán)隊(duì)探究了PPMC@CM如何調(diào)節(jié)B16-F10細(xì)胞中的氧化應(yīng)激。PPMC@CM組誘導(dǎo)了最顯著的GSH耗竭、ROS產(chǎn)生和LPO積累（圖5A-E）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PPMC@CM處理后的B16-F10細(xì)胞凋亡率顯著增強(qiáng)（圖5F-G）。

圖5.（A）不同處理6小時(shí)后B16-F10細(xì)胞內(nèi)GSH的相對(duì)水平。（B）激光共聚焦顯微鏡觀察B16-F10細(xì)胞與不同材料共孵育6小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平。比例尺：20 μm。（C）流式細(xì)胞儀分析B16-F10細(xì)胞經(jīng)不同處理6小時(shí)后的細(xì)胞內(nèi)ROS水平和（D）定量分析。（E）通過CLSM觀察不同處理6小時(shí)后B16-F10細(xì)胞中LPO的表達(dá)水平。（F）流式細(xì)胞術(shù)分析及（G）定量統(tǒng)計(jì)B16-F10細(xì)胞經(jīng)不同處理24小時(shí)后早期凋亡、晚期凋亡及壞死細(xì)胞的比例。

  團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步評(píng)估了PPMC@CM對(duì)缺氧-腺苷軸的抑制作用。結(jié)果表明，PPMC@CM組顯著緩解了腫瘤細(xì)胞的缺氧狀態(tài)（圖6A），并明顯降低了HIF-1α的表達(dá)水平（圖6B）。通過WB實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，PPMC@CM能夠有效抑制CD39/CD73的表達(dá)及ADO的生成（圖6C-E）。綜上，PPMC@CM通過改善細(xì)胞內(nèi)缺氧微環(huán)境，顯著抑制了缺氧-腺苷信號(hào)軸的激活，從而降低細(xì)胞外腺苷的水平（圖6F）。

圖6.（A）使用[Ru(dpp)₃]Cl₂探針檢測(cè)不同處理后B16-F10細(xì)胞中的O₂含量，比例尺：20 μm。缺氧條件下，B16-F10細(xì)胞經(jīng)不同材料處理后（B）HIF-1α、（C）CD39和（D）CD73蛋白表達(dá)的Western blot分析及定量數(shù)據(jù)。（E）缺氧條件下，不同材料處理的B16-F10細(xì)胞中ADO水平。（F）PPMC@CM的抗腫瘤機(jī)制。

  研究團(tuán)隊(duì)通過建立B16-F10腫瘤模型，評(píng)估了PPMC@CM在活體內(nèi)的MR成像性能。結(jié)果顯示，給藥后兩組腫瘤部位的MR信號(hào)強(qiáng)度均迅速升高，并在0.5小時(shí)達(dá)到峰值后逐漸衰減，其中PPMC@CM組的信號(hào)強(qiáng)度顯著高于PPMC組（圖7A-B）。進(jìn)一步分析PPMC@CM在體內(nèi)的生物分布發(fā)現(xiàn)，注射0.5小時(shí)后，Mn元素在腫瘤組織中的蓄積量達(dá)到最高，隨后逐漸被代謝清除（圖7C-D）。

圖7.（A）瘤周注射PPMC或PPMC@CM后不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體內(nèi)T₁加權(quán)MR成像圖及（B）腫瘤部位MR信噪比定量分析。不同時(shí)間點(diǎn)通過瘤周注射（C）PPMC和（D）PPMC@CM后，小鼠主要器官和腫瘤中的Mn元素含量。

  研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)評(píng)估了PPMC@CM對(duì)B16-F10荷瘤小鼠的抗腫瘤療效。結(jié)果顯示，治療期間各組小鼠體重?zé)o明顯變化，表明實(shí)驗(yàn)材料均未表現(xiàn)出明顯毒性（圖8A-B）。PPMC@CM治療組表現(xiàn)出最優(yōu)異的抗腫瘤效果，其腫瘤體積和重量均顯著低于其他組（圖8C-E）。進(jìn)一步通過組織病理學(xué)分析（H&E、TUNEL和Ki67）證實(shí)，PPMC@CM能顯著誘導(dǎo)腫瘤組織壞死和細(xì)胞凋亡，同時(shí)有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖（圖8F）。

圖8.（A）B16-F10小鼠腫瘤模型建立及抗腫瘤治療方案的示意圖。治療期間B16-F10荷瘤小鼠的（B）體重以及（C）腫瘤相對(duì)體積變化。（D）末次給藥后剝離腫瘤的實(shí)物照片和（E）剝離腫瘤的重量統(tǒng)計(jì)。（F）第13天B16-F10腫瘤組織的H&E、TUNEL和Ki-67染色。比例尺：20 μm。

  最后，研究團(tuán)隊(duì)深入探究了PPMC@CM的抗腫瘤作用機(jī)制。免疫熒光染色與ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，PPMC@CM治療組腫瘤組織中PD-L1、HIF-1α、CD39及CD73的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（圖9A-E）。同時(shí)，腫瘤部位的CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量明顯增加（圖9G-I）。

圖9.（A）B16-F10腫瘤切片中PD-L1、HIF-1α、CD39和CD73的免疫熒光染色。比例尺：20 μm。不同治療組B16-F10腫瘤組織中（B）PD-L1、（C）HIF-1α、（D）CD39和（E）CD73在的表達(dá)定量分析（1：PBS；2：PPM；3：PPMC；4：PPMC@CM）。（F）不同治療組血清中ADO的含量。（G）不同治療組B16-F10腫瘤切片中CD4和CD8的免疫熒光染色。比例尺：20 μm。不同治療組B16-F10腫瘤切片中（H）CD4⁺ T細(xì)胞和（I）CD8⁺ T細(xì)胞數(shù)量定量分析。

  PPMC@CM可顯著促進(jìn)脾臟中CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞的增殖活化（圖10A-E），降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）的比例，并顯著提升血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表達(dá)水平（圖10F-H）。

圖10. 對(duì)不同處理后荷瘤小鼠脾臟（A）CD4⁺/CD8⁺ T細(xì)胞和（B）Tregs進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。（C）CD4⁺、（D）CD8⁺ T細(xì)胞比例和（E）Tregs比例的相應(yīng)定量。不同組小鼠治療13天后血清中（F）TNF-α、（G）IFN-γ和（H）IL-6水平。

  簡(jiǎn)而言之，團(tuán)隊(duì)所構(gòu)建的PPMC@CM納米平臺(tái)通過同源靶向作用在腫瘤部位高效富集，釋放的MnO₂可產(chǎn)生氧氣緩解腫瘤缺氧，同時(shí)消耗GSH以增強(qiáng)Mn²⁺介導(dǎo)的類芬頓反應(yīng)，從而顯著提升CDT療效并實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向MRI成像。此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)有效敲除PD-L1基因，同時(shí)腫瘤缺氧的改善能抑制免疫抑制性的缺氧-腺苷能軸，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫治療效果，激活強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。本研究將CRISPR/Cas9-PD-L1系統(tǒng)與缺氧-腺苷軸抑制策略相結(jié)合，為設(shè)計(jì)黑色素瘤診療一體化的仿生納米平臺(tái)提供了新思路。

  以上研究成果以“A Biomimetic Nanoplatform Mediates Hypoxia-Adenosine Axis Disruption and PD-L1 Knockout for Enhanced MRI-Guided Chemodynamic-Immunotherapy”為題，在線發(fā)表于國(guó)際著名期刊 Acta Biomaterialia (DOI: 10.1016/j.actbio.2025.06.021 )。東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院郭睿教授與史向陽教授為共同通訊作者，東華大學(xué)碩士研究生孫夢(mèng)宇為第一作者。該工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)等的資助。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2025.06.021