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  蛋白質(zhì)被廣泛用作治療劑和生物催化劑，用于治療多種重大疾病和工業(yè)生產(chǎn)。然而，蛋白質(zhì)固有的不穩(wěn)定性使其在生產(chǎn)、制造、儲存、運輸和應(yīng)用過程中容易受到多種環(huán)境脅迫而發(fā)生構(gòu)象改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊和聚集，這嚴(yán)重?fù)p害了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和有效性，限制了其應(yīng)用。這些壓力包括高溫、機械力、冷凍干燥、暴露于極端pH值以及有機溶劑中。因此，幫助蛋白質(zhì)保持構(gòu)象、阻止蛋白質(zhì)聚集以及促進(jìn)遭受環(huán)境壓力后蛋白質(zhì)的重新折疊對于保持蛋白質(zhì)的生物活性至關(guān)重要。

  近期，劉潤輝教授課題組報道了絲綢工業(yè)中廢棄的天然資源——絲膠蛋白，在多種環(huán)境脅迫下，均表現(xiàn)出優(yōu)異的蛋白質(zhì)穩(wěn)定功能，這一獨特優(yōu)勢使絲膠蛋白能夠提供單一保護(hù)劑無法實現(xiàn)的全面保護(hù)，其保護(hù)效果遠(yuǎn)優(yōu)于常用的各種蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，且突破了分子伴侶價格昂貴且不易獲取的局限性，具有價格低廉、容易獲得、具有優(yōu)異生物相容性等優(yōu)點。該研究成果以“The Cheap Silk Sericin Displaying Chaperone-like Activity to Stabilize Protein and Facilitate Protein Refolding”為題發(fā)表在CCS Chemistry上（CCS Chem. 2025, Just Published. DOI: 10.31635/ccschem.025.202505877）。

  受晚期胚胎發(fā)生豐富（LEA）蛋白這一類具有高親水性且無明確結(jié)構(gòu)的特殊分子伴侶的啟發(fā)，作者聚焦于絲膠蛋白，一種具有高度親水性和高無規(guī)卷曲含量的天然蛋白質(zhì)，來源于蠶絲外層，并且在絲綢工業(yè)中被大量廢棄。作者研究發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白具有類似分子伴侶的活性，在各種環(huán)境壓力下有效地穩(wěn)定蛋白質(zhì)，例如高溫、機械力、酸性條件、存在有機溶劑、冷凍干燥和反復(fù)凍融。此外，他們觀察到絲膠蛋白還能促進(jìn)蛋白質(zhì)在受外界因素變性和解折疊后的再折疊（圖1）。

圖1. 絲膠蛋白的啟發(fā)來源與穩(wěn)定蛋白質(zhì)功能

  作者先以辣根過氧化物酶（HRP，pI = 8.9）為模型蛋白，研究絲膠蛋白（SS）在高溫條件下對蛋白質(zhì)的保護(hù)作用。并與海藻糖和蔗糖對比。加熱后，HRP活性明顯降低，而隨著絲膠蛋白含量的增加，HRP在熱應(yīng)激后的保留活性顯著提高（圖2）。并且顯著優(yōu)于常用的蛋白質(zhì)分子伴侶，海藻糖和蔗糖。DLS和TEM表明絲膠蛋白可有效阻止蛋白質(zhì)聚集，差式掃描熒光法表明加入絲膠蛋白后，HRP的熱穩(wěn)定性顯著提升。此外，將HRP熱變性后，再加入絲膠蛋白還可促進(jìn)蛋白質(zhì)的再折疊（圖2）。

圖2. 絲膠蛋白在高溫下可有效穩(wěn)定蛋白質(zhì)

  蛋白質(zhì)在生產(chǎn)、制造、儲存、運輸和應(yīng)用等整個生命周期中，除了高溫外，還會受到酸性條件、有機溶劑、機械力和冷凍干燥等其他環(huán)境壓力。這些壓力會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和失活，從而降低其生物活性，因此作者使用HRP進(jìn)一步探究絲膠蛋白保護(hù)蛋白質(zhì)免受這些環(huán)境壓力影響的能力（圖3）。結(jié)果表明絲膠蛋白在酸性條件、有機溶劑、機械力和冷凍干燥這些環(huán)境壓力下對蛋白質(zhì)仍具有優(yōu)異的穩(wěn)定效果。

圖3. 絲膠蛋白在機械力、冷凍干燥、暴露于極端pH和有機溶劑環(huán)境壓力下對蛋白質(zhì)具有穩(wěn)定效果

  為了探究絲膠蛋白穩(wěn)定蛋白質(zhì)功能的普適性，作者研究發(fā)現(xiàn)絲膠蛋白對具有不同理化性質(zhì)的蛋白質(zhì)（等電點從4.3到11.0）均可顯著提升其熱穩(wěn)定性。作者進(jìn)一步研究表明與HRP類似，絲膠蛋白對β-半乳糖苷酶（β-Gal，pI = 4.6）和葡萄糖氧化酶（Gox，pI = 4.6）在多種環(huán)境壓力下也展現(xiàn)出非常優(yōu)異的穩(wěn)定效果。此外，研究表明絲膠蛋白還可以有效保護(hù)治療性蛋白質(zhì)如抗體免受各種環(huán)境壓力的損害（圖4）。

圖4. 絲膠蛋白在各種環(huán)境壓力下對具有不同理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定效果

  為了探究絲膠蛋白穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用機制，PEG，一種常用的擁擠劑；和BSA，一種具有明確三級結(jié)構(gòu)，且具有類似分子伴侶活性的蛋白質(zhì)被用作對照。結(jié)果表明，在高溫、有機溶劑和酸性條件下，PEG的保護(hù)作用非常有限甚至沒有，表明在蛋白質(zhì)濃度較低的情況下，排除體積效應(yīng)在這些環(huán)境脅迫下起的保護(hù)作用非常有限。BSA在有機溶劑和酸性條件下有較好的保護(hù)效果，表明其能夠通過與蛋白質(zhì)相互作用來保護(hù)蛋白質(zhì)免受環(huán)境脅迫的影響。然而，BSA自身穩(wěn)定性有限導(dǎo)致其在高溫和攪拌條件下對蛋白質(zhì)幾乎沒有保護(hù)效果。絲膠蛋白作為一種高親水性且無明確結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，在所有的這些環(huán)境脅迫下都表現(xiàn)出顯著的保護(hù)效果（圖5）�；谝陨辖Y(jié)果，作者推測絲膠主要通過與蛋白質(zhì)相互作用并形成保護(hù)層來保護(hù)蛋白質(zhì)免受環(huán)境脅迫。

圖5. 絲膠蛋白作用機制研究

  作者進(jìn)一步使用全原子分子動力學(xué)(MD) 模擬，通過分析絲膠蛋白與HRP之間的相互作用來驗證上述猜想，結(jié)果顯示絲膠蛋白鏈圍繞在 HRP 周圍形成屏障，減少了HRP的構(gòu)象變化及殘基波動，從而迫使蛋白質(zhì)維持其初始構(gòu)象。絲膠蛋白與HRP相互作用能的分析表明絲膠蛋白與HRP之間存在范德華力和靜電相互作用（圖6）。此外，等溫滴定量熱法（ITC）為絲膠蛋白與辣根過氧化物酶（HRP）的結(jié)合提供了直接證據(jù)。

圖6. 分子動力學(xué)模擬研究絲膠蛋白作用機制

  蛋白質(zhì)固有的不穩(wěn)定性使其在各種環(huán)境脅迫下易發(fā)生去折疊和聚集，嚴(yán)重?fù)p害了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和有效性，限制了其應(yīng)用。絲膠蛋白突破了現(xiàn)有分子伴侶成本高昂、結(jié)構(gòu)復(fù)雜和難以獲取等問題，以及單一保護(hù)劑無法應(yīng)對多重環(huán)境脅迫的局限性，同時具備價格低廉、容易獲取、生物相容性好等諸多優(yōu)點，在蛋白質(zhì)藥物保存、生物制劑開發(fā)和工業(yè)酶應(yīng)用等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

  華東理工大學(xué)博士生張君宇是該論文的第一作者，華東理工大學(xué)劉潤輝教授是通訊作者。該研究得到了國家自然科學(xué)基金委等基金的資助。

  論文鏈接: https://www.chinesechemsoc.org/doi/epdf/10.31635/ccschem.025.202505877