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東華大學沈明武研究員/史向陽教授團隊:不對稱含磷樹狀大分子遞送菠蘿蛋白酶用于骨關節(jié)炎的抗炎和軟骨保護治療
2025-06-13  來源:高分子科技

  骨關節(jié)炎(OA患者的關節(jié)軟骨組織會發(fā)生不受控制的惡性退化。因此,各種具有抑制軟骨細胞凋亡、改善軟骨細胞合成代謝、誘導骨髓間充質干細胞軟骨分化和減少軟骨磨損功能的治療策略被開發(fā)以保護或再生軟骨組織。然而,持續(xù)炎癥引發(fā)的滑膜炎是另一個不容忽視的重要病理特征。巨噬細胞是滑膜中最豐富的免疫細胞,通過在M1M2之間切換免疫表型,影響各種細胞反應和生物過程。在這種情況下,過度激活的滑膜巨噬細胞(M1 型)會在關節(jié)部位主導許多促炎細胞因子和分解因子的分泌,包括腫瘤壞死因子TNF-α)、環(huán)氧化酶-2COX-2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素 E2PGE2)和基質金屬蛋白酶(MMPs)。這些介質的產(chǎn)生會誘導細胞外基質降解和軟骨細胞功能障礙,從而加劇 OA 的進展。因此,可通過調節(jié)免疫微環(huán)境來極化激活的巨噬細胞,減少炎性細胞因子的分泌,從而實現(xiàn)對OA的綜合治療。


  菠蘿蛋白酶(Bro)是一種從菠蘿根莖中提取的天然產(chǎn)品,已被用于治療不同的炎癥性疾病,如骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎和哮喘。Bro 通過抑制巨噬細胞中的核轉錄因子-κBNF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號通路,具有強大的抗炎作用和巨噬細胞極化能力。同時,Bro 還能通過調節(jié)COX-2的表達,阻止花生四烯酸轉化為前列腺素,從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而,Bro 的高分子量和親水性使其具有膜不滲透性,難以被靶細胞吞噬,因此在生物體內(nèi)的治療活性有限。幸運的是,幾種具有巨噬細胞極化和自然殺傷NK細胞增殖特性的磷樹狀分子被報道作為高效、安全的載體用于細胞內(nèi)蛋白質傳遞。特別是亞磷鈉鹽末端的含磷樹狀大分子可放大所遞送蛋白質的生物活性,同時協(xié)同載體固有的抗炎活性。由于不對稱陽離子含磷樹狀大分子表現(xiàn)出優(yōu)越且未受損的基因壓縮和傳遞特性,因此他們假設含磷樹狀大分子的結構不對稱可能影響蛋白質的細胞內(nèi)傳遞效率,從而改善疾病的治療效果。


  為了解決以上問題,東華大學沈明武研究員/史向陽教授團隊法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral院士團隊合作設計和合成了一種不對稱型亞磷酸鈉鹽末端的含磷樹狀大分子(G0.PD-ABP),并分析其與對稱型含磷樹狀大分子(G0.PD)之間的抗炎和蛋白質遞送性能差異。此外,這種不對稱型含磷樹狀大分子G0.PD-ABP作為增強Bro細胞內(nèi)遞送的載體,通過抑制巨噬細胞內(nèi)相關炎癥信號通路的激活來誘導巨噬細胞向M2極化,并抑制軟骨細胞凋亡,實現(xiàn)OA的抗炎和軟骨保護治療(圖1)。



1. G0.PD-ABP/Bro的制備和治療機制示意圖。


  研究團隊利用核磁共振氫譜和磷譜證明了G0.PD-ABP的成功合成(圖2A。兩種含磷樹狀大分子(G0.PDG0.PD-ABP均顯著下調TNF-αmRNA表達水平上調IL-10mRNA表達水平,但兩者之間沒有顯著差異(圖2B)。流式細胞術結果顯示,兩種含磷樹狀大分子均能抑制激活的巨噬細胞中CD86的表達并促進CD206的表達,但兩種含磷樹狀大分子誘導巨噬細胞向M2極化的能力沒有顯著差異,進一步表明結構對稱性并沒有增強含磷樹狀大分子的免疫調節(jié)活性(圖2C-D。



2.AG0.PDG0.PD-ABP的化學結構式。(BG0.PDG0.PD-ABP處理LPS激活的RAW264.7細胞中TNF-αIL-10 mRNA表達水平的變化。(C-DG0.PDG0.PD-ABPLPS激活的RAW264.7細胞中CD86CD206表達影響的流式細胞術結果。


  研究團隊發(fā)現(xiàn),G0.PDG0.PD-ABP可以與Bro復合成穩(wěn)定的納米顆粒(圖3A-C),其中G0.PD-ABPBro形成的納米顆粒呈現(xiàn)均勻分布的球形,大小為148.4 nm(圖3D)。所形成的G0.PD/BroG0.PD-ABP/Bro納米顆粒具有良好的細胞相容性(圖3E),并能改善Bro的細胞內(nèi)遞送效果(圖3F)。其中,不對稱型的G0.PD-ABP細胞內(nèi)遞送Bro的能力顯著高于對稱結構的G0.PD(圖3F-G)。G0.PD-ABP/Bro介導Bro細胞內(nèi)遞送是時間依賴性的,并通過網(wǎng)格蛋白和胞飲介導的內(nèi)吞途徑內(nèi)化至細胞內(nèi)(圖3H-I)。



3.AG0.PDG0.PD-ABPBro絡合示意圖。(B-CBro、G0.PD/BroG0.PD-ABP/BroDLS結果。(DG0.PD-ABP/BroTEM圖像。(EBroG0.PD/BroG0.PD-ABP/BroRAW264.7細胞活力的影響。(F-GBroG0.PD/BroG0.PD-ABP/Bro處理的RAW264.7細胞后細胞內(nèi)的熒光強度的流式細胞術和CLSM結果。(HG0.PD-ABP/Bro處理細胞不同時間后細胞內(nèi)的相對熒光強度。(I)不同內(nèi)吞抑制劑預處理對細胞攝取G0.PD-ABP/Bro效果的影響。


  研究團隊分析了G0.PD-ABP/Bro對巨噬細胞表型的調節(jié)作用以及抗炎活性。流式細胞術結果顯示,G0.PD-ABP/Bro表現(xiàn)出優(yōu)于G0.PD/Bro的巨噬細胞表型調節(jié)能力,這可能得益于不對稱性的含磷樹狀大分子具有更好的Bro遞送效果(圖4A-C)。同時,G0.PD-ABP/Bro可以抑制促炎性細胞因子TNF-α促進抗炎細胞因子IL-10的分泌(圖4D,同時抑制炎癥介質一氧化氮的產(chǎn)生(圖4E,這種優(yōu)異的抗炎活性主要來源于納米藥物對NF-κB、COX-2iNOS等炎癥信號通路的抑制作用(圖4F。重要的是,由于G0.PD-ABP/Bro處理的巨噬細胞可分泌大量的生長因子和抗炎因子,其來源的條件培養(yǎng)基有助于抑制軟骨細胞的凋亡(圖4G-H)。



4.A-C不同材料處理后巨噬細胞極化的流式細胞圖。(D)檢測不同材料處理后細胞上清液中的TNF-αIL-10的表達水平。(E)檢測不同材料處理后細胞上清液中NO的表達水平。(FWB檢測不同處理后細胞內(nèi)iNOS、COX-2p-p65的表達水平;(G-H)不同條件培養(yǎng)基處理后軟骨細胞的凋亡和壞死情況。


  研究團隊通過構建小鼠OA模型驗證G0.PD-ABP/Bro的體內(nèi)治療效果(圖5A在圖5B-C中,番紅-O-固綠和MMP-13染色結果顯示G0.PD-ABP/Bro治療后可以抑制軟骨組織降解,表現(xiàn)為軟骨層增厚、番紅-O-固綠染色均勻、基質金屬蛋白酶MMP-13的表達降低,其治療效果優(yōu)于G0.PD/Bro。另外,OA小鼠的炎性膝關節(jié)的Micro-CT結果顯示,G0.PD-ABP/Bro治療組的軟骨和骨侵蝕程度明顯得到改善,軟骨表面完整光滑,結構恢復至正常小鼠水平(圖5D)。Micro-CT的定量結果進一步支持了這一發(fā)現(xiàn)(圖5E-G)。



5.AOA小鼠模型的體內(nèi)治療方案;(B)不同治療后小鼠炎癥膝關節(jié)的番紅-O-固綠染色。(C)不同治療后小鼠炎癥膝關節(jié)的MMP-13免疫熒光切片染色;(D-G)不同治療后小鼠炎癥膝關節(jié)的Micro-CT成像圖以及BV/TV、BMD、Tb.Th定量結果。


  滑膜區(qū)的iNOSCD206染色結果顯示G0.PD-ABP/Bro成功誘導滑膜巨噬細胞向M2表型極化,這表現(xiàn)為降低的紅色熒光信號和增強的綠色熒光信號(圖6A)。這種M2巨噬細胞極化能力有效緩解OA炎癥膝關節(jié)部位的滑膜炎,降低滑膜厚度,炎癥細胞浸潤減少(圖6B-C)。不同治療組小鼠血清的ELISA檢測結果進一步證實了G0.PD-ABP/Bro杰出的抗炎活性(圖6D)?偟膩碚f,這種不對稱含磷樹狀大分子基的Bro遞送系統(tǒng)可以通過巨噬細胞重編程成功實現(xiàn)在OA小鼠模型中的抗炎和軟骨保護治療。



6.A)不同材料治療后OA小鼠滑膜區(qū)域的iNOSCD206免疫熒光染色結果。(B)不同材料治療后OA小鼠滑膜區(qū)域的H&E染色結果和(C)滑膜炎評分。(D)不同材料治療后OA小鼠血清中各種細胞因子的表達水平。


  簡而言之,該研究設計的基于不對稱含磷樹狀大分子的Bro遞送平臺具有多個優(yōu)勢:1闡明含磷樹狀大分子的結構不對稱性在蛋白質傳遞中的作用;2利用G0.PD-ABP提高Bro的胞內(nèi)遞送效率;3整合G0.PD-ABPBro固有的免疫調節(jié)特性實現(xiàn)OA的有效抗炎和抗軟骨凋亡治療。本研究強調了含磷樹狀大分子的結構不對稱在蛋白質傳遞中的積極貢獻,并為通過增強巨噬細胞的免疫調節(jié)治療OA或其他炎癥性疾病提供了可行的策略。


  以上研究成果以Asymmetric bioactive phosphorus dendrimers deliver bromelain for enhanced anti-inflammation and chondroprotection therapy of osteoarthritis為題,在線發(fā)表于國際著名期刊Chinese Chemical Letters (DOI: 10.1016/j.cclet.2025.111446)。東華大學生物與醫(yī)學工程學院沈明武研究員史向陽教授鄒瑜(博士后)為共同通訊作者,東華大學博士生孫虎嘯和博士生李錦為共同第一作者。該工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金項目、上海市科委項目、中國-中東歐國家聯(lián)合教育項目、中央高;究蒲袠I(yè)務費專項資金-東華大學研究生創(chuàng)新基金資助等項目的資助。


  文章鏈接:https://doi.org/10.1016/j.cclet.2025.111446

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(責任編輯:xu)
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