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康復大學周祺惠團隊/青大附院王志國 AFM：生物活性角蛋白水凝膠微針貼片用于病理性瘢痕治療
2024-10-03  來源：高分子科技

  病理性瘢痕（Pathological scars，PS）是傷口異常愈合導致皮膚過度纖維化的結(jié)果，包括增生性瘢痕（Hypertrophic scars）和瘢痕疙瘩（keloids），發(fā)病原因與炎癥反應和肌成纖維細胞的過度激活密切相關(guān)。它不僅凸出皮膚表面過度增生，而且會導致皮膚與關(guān)節(jié)功能障礙、瘙癢或有刺痛灼熱感，逐漸發(fā)展長大后會形成大面積瘢痕腫塊，嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。目前，治療瘢痕疙瘩的方式包括手術(shù)切除、放療、光電、局部注射糖皮質(zhì)激素和硅酮凝膠貼等。這些治療方法具有相關(guān)缺陷，如手術(shù)或放療后的高復發(fā)率（20%~90%）和導致正常組織損傷、減張/加壓/保濕治療所需時間過久，且無法根治。其中，經(jīng)皮注射相關(guān)藥物治療被認為是最方便、最有效的策略之一，因為它能夠穿透致密的瘢痕組織，使藥物直接作用于病變部位。但局部注射引起的劇烈疼痛讓患者難以接受，且具有藥物吸收快、不均勻分布和需要專業(yè)醫(yī)務人員操作缺點。因此，制定一種自我管理策略，實現(xiàn)均勻、緩慢地、微創(chuàng)的經(jīng)皮注射給藥，對PS的有效治療至關(guān)重要。


  基于以上，來自康復大學周祺惠研究員團隊與青島大學附屬醫(yī)院王志國主任合作，開發(fā)了一種基于脂肪來源干細胞濃縮條件培養(yǎng)基（ADSCC-CM）交聯(lián)角蛋白水凝膠的新型微針（MN）貼片，用于負載曲安奈德（TA），通過ADSCC-CM和TA的雙藥物遞送，發(fā)揮減輕炎癥和調(diào)控肌成纖維細胞行為的協(xié)同作用，同時達到避免現(xiàn)有治療技術(shù)缺點的目的。該研究以題為“ADSCC-CM-Induced Keratin Hydrogel-Based Bioactive Microneedle Patch Containing Triamcinolone Acetonide for the Treatment of Pathological Scar”發(fā)表在《Advanced Functional Materials》期刊上。青島大學附屬醫(yī)院燒傷整形外科碩士研究生李聰和康復大學易兵成副研究員為本論文共同第一作者。


  本研究首次發(fā)現(xiàn)ADSCC-CM可與角蛋白相互交聯(lián)形成水凝膠，通過攜載臨床PS治療常用藥物TA，創(chuàng)新性地使用該水凝膠制作成微針貼片（TA@AC-MN），以微創(chuàng)的方式實現(xiàn)ADSCC-CM和TA雙藥物釋放。TA@AC-MN的制備工藝包括提取人發(fā)來源角蛋白、制備ADSCC-CM和提高TA溶液的分散穩(wěn)定性。TA@AC-MN治療PS的機制是通過TA和ADSCC-CM對肌成纖維細胞表型和組織炎癥抑制的協(xié)同作用（圖1）。


圖1. TA@AC-MN的制備和治療PS的示意圖。


  具體到AC-MN的制備過程，使用化學還原法提取人發(fā)角蛋白，將獲取的脂肪間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基通過冷凍干燥機制備ADSCC-CM。在真空條件下，將PBS溶液沉淀到PDMS模具中去除空氣。隨后，將含角蛋白和ADSCC-CM的PBS溶液使用超聲震蕩融進于每個針腔中，并使溶液均勻分散。去除多余的溶液，在空氣中靜置形成水凝膠后，將透明質(zhì)酸鈉(HA)溶液加載到模具上，待完全干燥，即獲得AC-MN微針貼片。通過電鏡掃描、承重實驗、透皮實驗等證明ADSCC-CM與角蛋白交聯(lián)形成的水凝膠所制備的微針具有良好的形態(tài)和機械性能，足以保證刺破皮膚達到藥物遞送的目的（圖2）。


圖2. AC-MN制作過程及表征。


  在對肌成纖維細胞表型調(diào)控方面，作者選用人增生性瘢痕成纖維細胞（HSFs）作為細胞模型驗證效果。通過細胞活力CCK-8分析，可以發(fā)現(xiàn)ADSCC-CM和TA在抑制HSFs活力方面具有協(xié)同作用。在脂多糖（LPS）的炎癥環(huán)境刺激下，通過DCFH探針技術(shù)監(jiān)測活性氧(ROS)含量，觀察到ADSCC-CM和TA可以明顯減少炎癥刺激下HSFs的ROS產(chǎn)生；同時，在PCR實驗中研究證實ADSCC-CM和TA可以明顯抑制HSFs與瘢痕形成相關(guān)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄（圖3）。


圖3. 體外評價ADSCC-CM和TA對抑制HSFs過度活化和炎癥反應的協(xié)同作用。


  在構(gòu)建的兔耳瘢痕模型中，TA@AC-MN對瘢痕起到良好的治療效果。TA@AC-MN治療之后的瘢痕外觀更加接近正常皮膚。通過超聲波測量計算瘢痕指數(shù)（SEI），TA@AC-MN治療效果與TA注射的方式效果相近，分別為1.36和1.31。并且生物力學檢測實驗證實TA@AC-MN可明顯提高瘢痕修復后的最大抗牽拉力（圖4）。


圖4. TA@AC-MN對兔耳瘢痕模型治療的體內(nèi)評價


  對于所設計微針的體內(nèi)抗炎作用分析，一方面，透光實驗反映出TA@AC-MN可以明顯減少因炎癥反應導致紅腫的面積；另一方面，通過免疫組織化學分析，進一步證實TA@AC-MN可抑制與PS形成相關(guān)的促炎癥因子的表達，并促進抗炎因子的表達（圖5）。


圖5. TA@AC-MN對兔耳瘢痕炎癥的抑制作用評價


  為更好地評價TA@AC-MN對PS的治療效果。該研究進行了H&E染色、Masson染色、Sirius染色，以對瘢痕修復后的微觀層面評估。H&E染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)TA@ACMN治療后，瘢痕的表皮和真皮組織厚度明顯減少，接近正常皮膚厚度，并伴有成纖維細胞密度降低和膠原排列規(guī)律增加。在評估瘢痕修復后膠原變化方面，Masson染色結(jié)果顯示紅色的肌纖維大量減少，呈現(xiàn)以藍色膠原纖維為主的瘢痕修復，表明MN貼片可以有效抑制肌成纖維細胞的活化；而在瘢痕修復后期，TA@AC-MN可以促進膠原重塑，使膠原排列更加接近于正常皮膚的膠原排列。Sirius染色的結(jié)果證實TA@AC-MN治療可以促進I型膠原和III型膠原比例趨于正常，實現(xiàn)趨向于健康皮膚修復的目的，避免瘢痕形成（圖6）。


圖6. TA@AC-MN治療后家兔耳瘢痕組織分析


  在治療機制探討方面，作者通過免疫組織化學進一步分析，證實TA@AC-MN可以抑制促進PS形成的相關(guān)蛋白TGF-β、WNT、TIMP-1表達（圖7）。


圖7. 免疫組織化學分析TA@AC-MN在瘢痕治療中的作用機制。


  綜上，該研究開發(fā)了一種基于ADSCC-CM交聯(lián)角蛋白水凝膠的新型微針貼片，用于負載TA，通過ADSCC-CM和TA的雙藥物遞送達到減輕嚴重炎癥和抑制HSF的過度激活來治療PS的目的。ADSCC-CM被首次報道用作交聯(lián)劑來構(gòu)建角蛋白水凝膠，其具有優(yōu)異的力學性能，并且可以成功穿透PS組織。當AC-MN作為藥物載體負載TA時，在TA@AC-MN中觀察到TA和ADSCC-CM的雙藥物釋放特征。重要的是，TA@AC-MN釋放的TA和ADSCC-CM在體外具有協(xié)同抑制HSF過度活化的作用。在兔耳瘢痕模型中給藥4周后，TA@AC-MN能達到有效改善瘢痕體積、彈性、色澤和緊致度的治療效果？傊，該研究驗證設計的TA@AC-MN顯示出治療PS的能力，該技術(shù)有望發(fā)展為一種自我管理、低成本、微創(chuàng)的PS臨床治療策略。


  該項目受到山東省泰山青年學者資助計劃（No. tsqn202306272）、山東省自然科學基金（No. ZR2020MH183、No. ZR2022MH191）、國家重點研發(fā)計劃課題（No. 2023YFFO715101）、國家自然科學基金（No. 82302388）、煙臺開發(fā)區(qū)產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才項目（No. 2021RC016）、青島市科技惠民示范工程（No. 24-1-8-smjk- 11-nsh）、青島市自然科學基金（No. 23-2-1-132-zyyd-jch）和山東省重大創(chuàng)新工程（No. 2019JZZY020219）支持。


  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202400457

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