川大張興棟院士團(tuán)隊(duì)王啟光/樊渝江 AM：靶向軟骨細(xì)胞的可注射在體FGF18基因編輯和自潤滑雜化外泌體微凝膠用于骨關(guān)節(jié)炎治療
骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，其主要特征為軟骨損傷、滑液潤滑減少和關(guān)節(jié)摩擦增加。在OA的早期階段，軟骨損傷會引起的關(guān)節(jié)摩擦增加，進(jìn)而加劇了軟骨細(xì)胞基因的異常表達(dá)，觸發(fā)了一系列相關(guān)的生物反應(yīng)，包括基質(zhì)降解酶的釋放、促炎細(xì)胞因子的分泌，以及細(xì)胞的沉默或衰老等。成纖維細(xì)胞生長因子18（FGF18）是OA發(fā)展中被異常沉默的關(guān)鍵基因之一，在軟骨再生過程中對細(xì)胞增殖和分化具有至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，FGF18能夠抑制OA的發(fā)展，并在各種動物模型中展現(xiàn)出良好的軟骨損傷愈合能力。目前，人源重組FGF18（也稱為sprifermin）正在進(jìn)行關(guān)節(jié)應(yīng)用的臨床試驗(yàn)。然而，作為一種蛋白質(zhì)藥物，sprifermin面臨著一些挑戰(zhàn)，包括其半衰期短、遞送效率低，以及需要反復(fù)進(jìn)行關(guān)節(jié)注射等問題。因此，尋找新的治療策略以克服這些挑戰(zhàn)，對于改善OA患者的生活質(zhì)量具有重要意義。
針對以上問題，四川大學(xué)張興棟院士團(tuán)隊(duì)王啟光/樊渝江報(bào)道了一種基于CRISPR/Cas9在體基因編輯的方法，利用可特異性靶向軟骨細(xì)胞的雜化外泌體（CAP/FGF18-hyEXO）裝載FGF18基因編輯工具，有效地在體內(nèi)基因組層面激活OA軟骨細(xì)胞的FGF18基因。在此基礎(chǔ)上，利用微流控和光聚合技術(shù)將其包封于甲基丙烯酸酐修飾的透明質(zhì)酸（HAMA）可注射性微凝膠中，通過脂質(zhì)邊界效應(yīng)形成自我更新的水合層，為運(yùn)動時的關(guān)節(jié)摩擦提供持久的潤滑作用。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合體內(nèi)FGF18基因編輯和持續(xù)潤滑可協(xié)同促進(jìn)軟骨再生、減輕炎癥和防止軟骨基質(zhì)降解，具有較大的臨床應(yīng)用潛力。該工作以“Injectable microgels with hybrid exosomes of chondrocyte-targeted FGF18 gene-editing and self-renewable lubrication for osteoarthritis therapy”在國際權(quán)威期刊Advanced Materials上發(fā)表。王啟光副研究員和樊渝江教授為該文的通訊作者，四川大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士生陳曼雨為文章第一作者。這項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目（32071353）的支持。
圖1 具有軟骨細(xì)胞靶向性在體FGF18基因編輯和自我再生潤滑功能的可注射性雜化外泌體微凝膠用于骨關(guān)節(jié)炎治療的示意圖
為實(shí)現(xiàn)FGF18的精準(zhǔn)在體編輯，研究團(tuán)隊(duì)首先轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定表達(dá)CAP/EGFP-Lamp2b質(zhì)粒與Cas9質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞，并通過超高速離心得到該細(xì)胞的外泌體CAP/EXO。接著，通過膜融合將CAP/EXO與負(fù)載SgFGF18的脂質(zhì)體進(jìn)行雜化，構(gòu)建了負(fù)載FGF18基因編輯工具的雜化外泌體CAP/hyEXO（圖1）。制備的CAP/hyEXO的粒徑大小與細(xì)胞外泌體CAP/EXO相似（約150-220 nm），呈現(xiàn)出球形囊泡的形態(tài)，并保留了外泌體的特異性膜蛋白，同時顯示出優(yōu)秀的穩(wěn)定性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，CAP/FGF18-hyEXO可顯著提高軟骨細(xì)胞中FGF18基因的表達(dá)，證明了Cas9-SgFGF18具有有效的FGF18基因調(diào)控能力（圖2）。
圖2. CAP/hyEXOs的制備和表征
研究人員利用基因工程技術(shù)成功實(shí)現(xiàn)了軟骨親和肽CAP對雜化外泌體CAP/hyEXO的修飾，以確保Cas9-SgFGF18在體內(nèi)精準(zhǔn)遞送至軟骨細(xì)胞。通過活體成像追蹤CAP/hyEXO在關(guān)節(jié)部位的滯留情況，發(fā)現(xiàn)CAP/FGF18-hyEXO在關(guān)節(jié)腔內(nèi)留存長達(dá)7天，并且不會脫靶積聚在其他器官中（圖3）。CAP/hyEXO表面微弱的正電荷特性，也間接地增強(qiáng)了其關(guān)節(jié)內(nèi)的靶向能力：由于分子靜電力作用，促使更多的CAP/hyEXO粘附聚集于帶負(fù)電荷的關(guān)節(jié)表面，并進(jìn)一步固定在軟骨組織內(nèi)帶負(fù)電的糖胺聚糖鏈接（圖3）。
圖3. CAP/hyEXOs的體內(nèi)外細(xì)胞靶向性研究
隨后，研究人員利用微流控和光聚合技術(shù)將雜化外泌體CAP/hyEXO包封于甲基丙烯酸酐修飾的透明質(zhì)酸（HAMA）為基體材料的微凝膠中，獲得了CAP/hyEXO均勻分散、平均粒徑為189.82±19.53μm的可注射微凝膠CAP/hyEXO@HMs。其中，CAP/hyEXO表面的陽離子和透明質(zhì)酸聚合物鏈中的陰離子的通過靜電分子力形成的緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了CAP/hyEXO的緩慢釋放和CAP/hyEXO@HMs緩慢降解，延長在關(guān)節(jié)內(nèi)的作用時間（圖4）。同時，與透明質(zhì)酸微球相比，可注射性微凝膠CAP/hyEXO@HMs在往復(fù)摩擦磨損試驗(yàn)中能保持穩(wěn)定的低摩擦系數(shù)（COF≈0.2）。CAP/hyEXO@HMs優(yōu)異的潤滑性能主要?dú)w因于脂質(zhì)邊界效應(yīng)機(jī)制：CAP/EXO@HMs可作為CAP/hyEXO的儲存層，在磨損過程中導(dǎo)致CAP/hyEXO的不斷暴露，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的水潤滑。CAP/hyEXO@HMs優(yōu)異的潤滑性能，能有效減輕關(guān)節(jié)磨損（圖4）。
圖4. 可注射CAP/hyEXO@HMs微凝膠的制備和表征
進(jìn)一步地，利用IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞模型研究了CAP/hyEXO@HMs對OA軟骨細(xì)胞的治療作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，CAP/hyEXO@HMs具有良好的細(xì)胞相容性，能夠促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞增殖、遷移、軟骨相關(guān)基質(zhì)分泌和ECM合成（圖6），并利用分子生物學(xué)手段，進(jìn)一步揭示了CAP/++FGF18-hyEXO@HMs對OA軟骨細(xì)胞的治療的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)通過FGF18上調(diào)激活了PI3K/AKT信號通路，從而促進(jìn)ECM再生，同時抑制炎癥和基質(zhì)降解（圖6）。
圖5.CAP/++FGF18-hyEXO@HMs促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞的增殖、遷移和ECM合成
圖6.CAP/++FGF18-hyEXO@HMs通過調(diào)控PI3K/ATK信號通路促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞再生軟骨基質(zhì)
為評價 CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的體內(nèi)治療效果，研究人員在基于ACLT法建立的大鼠膝關(guān)節(jié)OA模型中進(jìn)行了關(guān)節(jié)腔注射，并于術(shù)后8周和12周進(jìn)行了影像學(xué)和組織學(xué)分析。結(jié)果顯示，CAP/++FGF18-hyEXO@HMs組的骨贅形成少，軟骨基質(zhì)再生增加，與軟骨ECM蛋白、炎癥、基質(zhì)降解和PI3K信號通路相關(guān)的特定基因表達(dá)增強(qiáng)（圖7）。同時，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，進(jìn)一步地確認(rèn)了CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的體內(nèi)FGF18基因編輯和持續(xù)潤滑在關(guān)節(jié)炎治療中的協(xié)同作用，并探索了相關(guān)的作用機(jī)理（圖8），有利于在未來的研究中進(jìn)一步開發(fā)和優(yōu)化基于在體基因編輯的骨關(guān)節(jié)炎治療方案。
圖7 可注射CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微凝膠治療OA大鼠的效果表征
圖8可注射CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微凝膠治療OA大鼠的轉(zhuǎn)錄組分析
這項(xiàng)工作是該團(tuán)隊(duì)近期對工程化外泌體平臺構(gòu)建的最新進(jìn)展之一。該研究創(chuàng)新性地采用基于CRISPR的基因療法和微流控技術(shù)制備了一種可注射的CAP/FGF18-hyEXO@HMs，具有高效的體內(nèi)FGF18基因編輯和持續(xù)潤滑功能，有望解決人源重組FGF18蛋白質(zhì)藥物的半衰期短、遞送效率低，并需要反復(fù)關(guān)節(jié)注射等因缺陷。CAP/FGF18-hyEXO@HMs在體外和體內(nèi)均顯示出協(xié)同促進(jìn)軟骨再生、減輕炎癥和防止ECM降解的能力。本研究為基于CRIPSR基因編輯的OA治療提供了新思路，有望進(jìn)一步應(yīng)用于骨關(guān)節(jié)炎的臨床治療中。
論文信息：Manyu Chen, Yan Lu, Yuhan Liu, Quanying Liu, Siyan Deng, Yuan Liu, Xiaolin Cui, Jie Liang, Xingdong Zhang, Yujiang Fan, Qiguang Wang, Injectable Microgels with Hybrid Exosomes of Chondrocyte-Targeted FGF18 Gene-Editing and Self-Renewable Lubrication for Osteoarthritis Therapy. Adv. Mater. 2024, 2312559.
https://doi.org/10.1002/adma.202312559
