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  近日，廣東省人民醫(yī)院張余教授與華中科技大學楊光教授和武漢大學蔣序林教授合作開發(fā)了一種可注射水凝膠/多孔微球復合載藥的可控釋放體系，通過構(gòu)建組織修復的免疫微環(huán)境促進骨和軟骨的再生重建，是一種具有極高應用前景的軟骨修復策略。

  損傷軟骨缺損的纖維修復和軟骨下骨的不適當再生可導致再生軟骨的退變，最終導致軟骨修復的失敗，目前尚未有效的解決手段。近年來，基于免疫細胞調(diào)控促進組織修復正在成為研究的熱點和難點。為了探索免疫調(diào)節(jié)類的生物材料在骨軟骨再生中應用的可行性和科學性，本研究中研發(fā)了一種由多孔殼聚糖（CS）微球和羥丙基甲殼素（HPCH）水凝膠組成的具備巨噬細胞調(diào)節(jié)和可注射性能的 "積木式 "可控藥物遞送系統(tǒng)，其中二甲氧基甘氨酸（DMOG）負載于在溫敏HPCH水凝膠（HD）中，而Kartogenin（KGN）接枝于多孔CS微球（CSK-PMS）。研發(fā)的HD/CSK-PMS復合支架可有效地調(diào)節(jié)缺損部位的再生微環(huán)境，募集自體干細胞并提供豐富的細胞黏著位點，實現(xiàn)局部巨噬細胞的M2極化并促進骨軟骨的再生�？煽焖俳到獾�HD有利于透明軟骨再生，而高穩(wěn)定性的CSK-PMS則支持軟骨內(nèi)骨化和軟骨下骨的再生，為再生軟骨提供支撐。體外和體內(nèi)實驗評價顯示基于HD/CSK-PMS分層結(jié)構(gòu)的可控藥物輸送組合可有效調(diào)控M2巨噬細胞微環(huán)境，并促進軟骨缺損原位骨軟骨的再生。進一步通過組織染色、破骨Trap染色和免疫組化探索免疫調(diào)節(jié)類組織工程材料促進骨軟骨重建的機制。本研究結(jié)果揭示免疫微環(huán)境和軟骨下骨對高質(zhì)量軟骨修復的重要性，因此，基于免疫調(diào)節(jié)的水凝膠/PMS復合體系可能是一種具備極高應用前景的骨軟骨再生策略。

圖1. 復合體系促進骨軟骨修復的示意圖

  在這項工作中，作者首先構(gòu)建了多孔殼聚糖微球和具備溫敏性能的羥丙基甲殼素水凝膠，通過EDC-NHS化學方法將疏水性KGN接枝到具備豐富表面積的多孔微球表面及孔隙中，同時采用物理包埋的方式將親水性的DMOG負載至水凝膠中，多種載藥方式可實現(xiàn)親疏水藥物的可控釋放。進一步通過FTIR、電鏡、流變儀和藥物釋放等實驗對對該復合體系及其藥釋規(guī)律進行了表征。

圖2. 多孔微球及溫敏水凝膠載藥復合系統(tǒng)的制備及材料表征

  隨后，作者通過體外細胞實驗探究了復合體系對干細胞及巨噬細胞的募集作用及其直接和間接促軟骨分化的影響。CCK8、細胞骨架及電鏡結(jié)果表面多孔微球具備良好的生物相容性和細胞粘附性，微球個體間可通過表面的細胞互相連接，以“積木”的方式構(gòu)建組織模塊。

圖3. 多孔微球的細胞黏附和“積木”式組織模塊

  進一步通過細胞遷移實驗和RT-PCR實驗證明復合支架可以通過激活CCL2和MIF基因募集干細胞。同時基于電鏡、組織細胞染色和細胞外基質(zhì)成份分析闡明復合體系具備直接促進干細胞軟骨分化的作用，還可以通過巨噬細胞的刺激間接促進軟骨生成。

圖4. 復合體系的直接和間接促軟骨分化作用

  繼而以流式細胞分析、RT-PCR、Elisa和皮下植入的免疫熒光染色實驗探究了復合體系對巨噬細胞極化狀態(tài)的影響。結(jié)果表明復合體系可以有效地調(diào)節(jié)巨噬細胞的M2極化，其中DMOG是抑制M1而促進M2基因表達的關(guān)鍵因素，多孔殼聚糖微球可促進巨噬細胞向M2的轉(zhuǎn)化。

圖5. 復合體系的體內(nèi)植入巨噬細胞極化指標免疫熒光

  最后利用大鼠骨軟骨缺損模型，通過植入不同組合的水凝膠和多孔微球，優(yōu)化復合體系的組成，通過micro-CT、組織染色和評分對軟骨和軟骨下骨的再生修復效果進行全面評價，并通過延長植入時間（18w）觀察再生軟骨的穩(wěn)定性和質(zhì)量。通過Masson染色和破骨Trap染色探索軟骨下骨的修復模式及其對再生軟骨穩(wěn)定性的影響，并進一步通過巨噬細胞極化指標的免疫組化對軟骨缺損原位和關(guān)節(jié)滑膜對軟骨再生的免疫微環(huán)境進行評價和驗證，以闡明復合體系通過調(diào)控巨噬細胞的極化狀態(tài)促進骨軟骨修復的機制。

圖6. 不同組合的水凝膠/多孔微球復合支架植入骨軟骨缺損的示意圖

  相關(guān)研究工作目前以”Injectable immunomodulation-based porous chitosan microspheres/HPCH hydroge composites as a controlled drug delivery system for osteochondral regeneration”為題目發(fā)表在Biomaterials上，論文共同第一作者為廣東省人民醫(yī)院紀雄發(fā)博士后，華南理工大學邵宏偉碩士和上海硅酸鹽研究所李曉宏博士后。廣東省人民醫(yī)院張余教授、華中科技大學楊光教授、武漢大學蔣序林教授和廣東省人民醫(yī)院紀雄發(fā)博士后為該文章的共同通訊作者。

  本項目獲得了國家自然科學基金項目（32101097），中國博士后科學基金（2020M672558）,廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（A2020020）的支持。

  論文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0142961222001703