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  肌腱通過纖維軟骨界面(enthesis)插入骨骼，以減少機械張力和組織衰竭。盡管有這種增韌機制，但撕裂也會因為急性(超載)或降解(老化)過程而發(fā)生。而手術(shù)將撕裂的肌腱固定到骨中，會導(dǎo)致具有較低生物力學(xué)性能的瘢痕組織界面的形成。來自美國伊利諾大學(xué)厄巴納-香檳分校的Brendan A.C. Harley等人報道了一種創(chuàng)新的組織加固策略：包含骨性和腱性組織隔層的層狀支架，通過連續(xù)的聚乙二醇(PEG)水凝膠界面連接。調(diào)整水凝膠的凝膠動力學(xué)可以調(diào)節(jié)與側(cè)翼間室的整合，并產(chǎn)生生物力學(xué)性能優(yōu)勢。值得注意的是，在傳統(tǒng)的分層生物材料中，水凝膠界面減少了組織隔層間菌株濃度的形成，這可能會產(chǎn)生有害的生物效應(yīng)。這種機械堅固的分層復(fù)合生物材料的設(shè)計可能適用于廣泛的肌腱和韌帶-骨插入。相關(guān)論文以題為“Tough and tunable scaffold-hydrogel composite biomaterial for soft-to-hard musculoskeletal tissue interfaces”發(fā)表在Science Advances上。

1.背景介紹

  尾端是一種分層的纖維軟骨組織(250-500 μm寬)，包含細(xì)胞表型、生化信號、礦物質(zhì)含量、基質(zhì)成分和結(jié)構(gòu)排列的梯度，從而提供一個過渡區(qū)，通過該過渡區(qū)肌腱連接到骨骼。這種獨特的界面組織微環(huán)境通過提供一個持續(xù)的高順應(yīng)性的能量吸收區(qū)，促進了功能承載，這是拉伸載荷下組織增韌的一個重要機制。典型的尾端損傷是肩袖撕裂，急性超負(fù)荷、隨年齡增長的退化或兩者的結(jié)合導(dǎo)致肌腱到骨骼的局部或全寬度撕裂。肌腱再附著是臨床標(biāo)準(zhǔn)，但會導(dǎo)致狹窄的纖維血管瘢痕組織的形成，而不是一個梯度的纖維軟骨結(jié)束。在機械不匹配的肌腱和骨骼之間形成的銳邊界導(dǎo)致了應(yīng)變濃度，這大大增加了再次失敗的風(fēng)險(在一些老年人口中為90%)。撕裂組織的功能性恢復(fù)需要纖維軟骨順應(yīng)性界面的再生；然而，由于缺乏能夠滿足這些組織獨特功能需求的生物材料設(shè)計，再生修復(fù)策略的進展受到阻礙。

  分層生物材料為尾端的修復(fù)提供了潛在的優(yōu)勢。這些生物材料可以選擇性地呈現(xiàn)具有成分、結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征的優(yōu)化信號模式，這些特征在離散區(qū)域內(nèi)定制，以在空間上調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活性和組織重塑。為此，研究者最近描述了一種凍干方法來制造含有腱(各向異性)和骨(礦化)腔室的雙相膠原支架，這些腔室具有不同的組成和結(jié)構(gòu)，通過連續(xù)的界面連接。然而，這種雙相支架和大多數(shù)用于肌腱-骨結(jié)合修復(fù)的生物材料將肌腱-骨結(jié)合復(fù)制為肌腱和骨之間的梯度過渡，而不是一個獨特的多尺度組織。雖然在肌腱和骨修復(fù)的生物材料已經(jīng)取得了顯著的進展，但在生物材料中組織間的固有力學(xué)不匹配，可能在生物學(xué)和力學(xué)上對肌腱的修復(fù)是有害的。肌肉負(fù)荷是肌腱、骨和肌腱的發(fā)育和維持所必需的，也是損傷和修復(fù)后不可避免的。在這項研究中，研究者表明，在承受力矩驅(qū)動的拉伸載荷時，人類的肩膀在肌腱-骨骼插入處有可能產(chǎn)生大量的應(yīng)變濃度，這一特性取決于肩膀的整體剛度。在受載的分層充填生物材料中，在不同的腱和骨區(qū)域之間的界面上的力學(xué)不匹配同樣會導(dǎo)致應(yīng)變集中，這會大大降低細(xì)胞存活率并成為可能的骨折點。因此，由此產(chǎn)生的界面應(yīng)變導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)減弱，在需要再生的精確位置導(dǎo)致移植物失敗。

  在這里，研究者報告了一種獨特的生物材料增強基序的發(fā)展和驗證，其靈感來自于原生尾端的結(jié)構(gòu)-功能特性：在力學(xué)上不匹配的腱組織和骨組織間包含一個兼容的水凝膠界面。雖然這些設(shè)計元素在工程材料中很常見，但在組織工程生物材料中還沒有被探索過。研究者已經(jīng)開發(fā)了一種方法來控制在腱和骨間的柔性聚乙二醇(PEG)水凝膠帶的插入和穩(wěn)定之前描述的雙相膠原支架。由此產(chǎn)生的三相生物材料不同于缺乏連續(xù)界面的分層兩相或三相生物材料。研究表明，調(diào)整該水凝膠區(qū)制造參數(shù)提供了一種穩(wěn)健的方法，以降低在雙材料界面不匹配時形成的應(yīng)變濃度水平。水凝膠嵌入也顯著提高了整個組織支架的宏觀力學(xué)性能，并為組織工程方法提供了一種新的設(shè)計范式，以改善廣泛的肌肉骨骼組織插入的愈合。

2.材料與方法

2.1 水凝膠穩(wěn)定地集成不同的組織支架隔層

  研究者使用辣根過氧化物酶介導(dǎo)的化學(xué)聚合，將四臂PEG-硫醇單體共價交聯(lián)到界面水凝膠網(wǎng)絡(luò)中(圖1A)。這里，t_cross定義的是從主要粘性(G′ < G′′)到彈性(G′ > G′′)材料的轉(zhuǎn)換時間，而平衡存儲模量(G′_eq)是材料彈性響應(yīng)的量度。研究者從之前鑒定過的凝膠庫中選擇了一組PEG-SH水凝膠，以匹配凍干支架制造的時間范圍(t：0~60分鐘)，并具有一系列彈性行為(G′_eq: 4 to 15 kPa)(表1)。

表1 以前報告的SAOS測量中識別的水凝膠樣品一系列的測試集參數(shù)t_cross, Δt_gel和G′_eq。 

圖1 PEG水凝膠的交聯(lián)反應(yīng)與三相支架的制備。

  為了制造連續(xù)的三相支架，研究者采用了一種銅聚四氟乙烯(PFTE)模具，該模具允許水平裝載液體懸浮液，以便在凍干之前進行精確的分層和控制相擴散(圖1B)。經(jīng)凍干后，在結(jié)構(gòu)上形成了連接腱和骨支架間的PEG水凝膠界面層的連續(xù)三相支架(圖1C)。在模具一端，銅和PFTE之間的導(dǎo)熱系數(shù)不匹配建立了局部定向凝固，誘導(dǎo)形成各向異性的非礦化(腱狀)支架腔，而在模具另一端，形成了各向同性礦化(骨)膠原支架結(jié)構(gòu)。

2.2 界面水凝膠的整合和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)取決于凝膠動力學(xué)

  環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)的三相支架圖像表明，可以通過改變水凝膠的凝膠化性能來調(diào)整水凝膠界面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和摻入程度�？傮w而言，凝膠化速度快的水凝膠(快的t_cross和短的Δt_gel)更均勻地以明顯的單片水凝膠層混入支架中，而凝膠化速度慢的水凝膠則分布在兩側(cè)組織隔室的膠原纖維中(圖2A)，可能是由于水凝膠和膠原懸浮液之間擴展的擴散混合。支架與水凝膠界面的寬度也可以通過凝膠化來控制(圖2B)，從而可以根據(jù)不同的水凝膠化特性制備具有獨特界面區(qū)的三相支架。水凝膠界面分為快速(3~4分鐘)、中等(6分鐘)和慢速(12分鐘) t_cross；短(7-9分鐘)或長(31-51分鐘)Δt_gel; 以及低(1-5 kPa)或高(10-15 kPa) G′_eq。在這里，三相支架是通過這些獨特的凝膠化參數(shù)(t_cross:Δt_gel:G′_eq)來識別的，這些參數(shù)描述了從粘彈性轉(zhuǎn)變的時間(t_cross)，完成凝膠化的時間(Δt_gel)，以及水凝膠界面的最終彈性特性(G′_eq)。

圖2 界面水凝膠的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和寬度。

2.3 界面水凝膠可以調(diào)節(jié)支架對拉伸載荷的響應(yīng)

  研究表明，在單軸拉伸條件下，凝膠依賴于摻入柔性水凝膠層是一種有效的骨架增韌機制。與缺乏水凝膠插入的雙相支架相比，含有快速凝膠(t_cross)水凝膠配方(快速:長:高、快速:慢:低)的三相支架的大塊支架韌性顯著提高(圖3A)。韌性似乎不受總凝膠化時間 (Δt_gel) 或水凝膠相彈性性能(G′_eq)的強烈影響。快速膠凝合成的變體也比其他慢 t_cross 交聯(lián)的變體顯示出明顯更高的韌性，這表明在該制造方案中，需要一個特定的凝膠時間尺度納入到增韌界面水凝膠中。

  快速t_cross水凝膠增加韌性的機理是不同的(圖3B)。水凝膠長的Δt_gel和高G′_eq顯著提高了極限抗拉強度(圖3C)和三相的支架的彈性模量(圖3E)，從而形成了更高的應(yīng)力-應(yīng)變曲線以及最大承受應(yīng)力也隨之增加。相對地，具有短的Δt_gel和低的G′_eq(快：短：低)的水凝膠顯著增加了骨折前的應(yīng)變耐受性(圖3D)，彈性模量明顯降低，從而形成更具延展性的三相支架。這些不同的增韌機制在應(yīng)用生理壓力下是顯而易見的(圖3F-G)。在最大施加應(yīng)變?yōu)?%時，由于相對較低的壓力級別，更加延展快：短：低的變體比更高剛度快：長：高的變體明顯表現(xiàn)出較低的柔韌性。

圖3 塊狀支架在單軸拉伸下的力學(xué)性能。

2.4 水凝膠可以消除力學(xué)上完全不同組織隔層之間的界面張力

  為了便于實驗組之間的比較(圖4)，所有支架的應(yīng)變分布均使用相同的標(biāo)度進行報道，并使用個性化標(biāo)度來更準(zhǔn)確地顯示實驗組內(nèi)的應(yīng)變。在3.3%的塊狀實施應(yīng)變下，雙相支架在腱組織和骨性組織間的界面處出現(xiàn)了一個巨大的應(yīng)變(~10%)，這是最終在3.5%的塊狀實施應(yīng)變下的斷裂點(圖4A)。與雙相支架相比，三相支架沒有顯著增加韌性，在生物材料界面上顯示出相似的應(yīng)變濃度。然而，高韌性的三相變體在界面處顯示出明顯的應(yīng)變降低，而在彈性更強的腱區(qū)則顯示出明顯的應(yīng)變升高，在那里它們最終在8.7和7.4%的施放應(yīng)變下斷裂。隨后，研究者僅在腱組織和骨組織間的過渡區(qū)檢查了應(yīng)變剖面，獲得了更清晰的界面應(yīng)變表征(圖4B)。在3.3%的體應(yīng)變作用下，兩相支架界面出現(xiàn)了比整體應(yīng)變大7.2%的急劇應(yīng)變濃度，而高韌性的三相支架界面出現(xiàn)了均勻分布的應(yīng)變(~2%)，小于整體的體應(yīng)變作用。此外，三相支架在橫向上的界面應(yīng)變變異性比雙相支架低，說明界面水凝膠在其寬度上具有更均勻的應(yīng)變。

圖4 在單軸拉伸下，支架的局部應(yīng)變分布

2.5 人的肩膀在局部組織應(yīng)變中表現(xiàn)出僵硬依賴的變化

  研究者檢查了尸體捐獻者岡上肌腱和肩包膜的應(yīng)變分布。岡上肌腱被固定在一個測試儀器上，并施加扭矩載荷，導(dǎo)致在局部組織水平上的肌腱到骨骼的拉力載荷。在一個高剛度的試樣中，拉伸加載導(dǎo)致接近尾聲的應(yīng)變集中可以忽略不計。然而，在較低剛度的試樣中，拉伸加載導(dǎo)致約14%的應(yīng)變集中在尾端或靠近尾端。

4.結(jié)論與展望

  在此，研究者演示了一種以前未確認(rèn)的堅韌的、分層的生物材料，用于修復(fù)尾端創(chuàng)傷的制造和驗證。在不同的膠原蛋白支架之間加入一個順從的水凝膠界面，提供了一種生物激發(fā)增強方法，以有效地分散不同生物材料環(huán)境之間的局部應(yīng)變，并減少界面失效的發(fā)生。這個堅韌復(fù)合生物材料的模型可以為分層復(fù)合材料的生物激發(fā)增韌和一系列骨科插入損傷的堅固組織支架的設(shè)計提供新見解。

  參考文獻：Sun Han Chang et al., Sci. Adv. 2020; 6 DOI:10.1126/sciadv.abb6763

  原文鏈接：https://advances.sciencemag.org/content/6/34/eabb6763

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