天然酶，以其高催化效率、高底物特異性和可持續(xù)性等卓越優(yōu)勢，作為綠色催化劑在紡織、生物燃料、生命支持系統(tǒng)、食品、制藥以及醫(yī)療設(shè)備等領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。然而，在實(shí)際應(yīng)用過程中，天然酶面臨一系列棘手難題。當(dāng)外界環(huán)境中的溫度、pH 值或者溶劑等發(fā)生改變時(shí)，酶的結(jié)構(gòu)易應(yīng)激受損，從而降低催化性能，極大地限制了天然酶在工業(yè)領(lǐng)域的大規(guī)模推廣應(yīng)用。與此同時(shí)，酶出色的水溶性也為其循環(huán)利用設(shè)置了重重障礙。酶固定化（將酶固定在多孔載體上）可提高酶穩(wěn)定性和延長循環(huán)壽命，為酶催化劑的發(fā)展帶來新可能。在酶固定化領(lǐng)域中，物理吸附法憑借操作簡便等特性，在工業(yè)生產(chǎn)中依舊是常用且通用的技術(shù)手段，相關(guān)商業(yè)產(chǎn)品如Novozym®435已在市場上得到廣泛應(yīng)用。然而，物理吸附法存在著酶裝載效率低、固定不夠緊密以及酶易泄漏等先天性缺陷。盡管已有眾多相關(guān)應(yīng)對策略，但常伴隨酶活性降低、孔堵塞而限制底物擴(kuò)散等新問題。因此，開發(fā)一種能夠原位實(shí)施、經(jīng)濟(jì)高效且適用于大規(guī)模生產(chǎn)的策略，增強(qiáng)物理吸附法固定化酶體系在工業(yè)環(huán)境中的穩(wěn)定性和使用壽命，成為了當(dāng)前該領(lǐng)域亟待攻克的關(guān)鍵課題。
硅基基質(zhì)具有化學(xué)惰性、機(jī)械強(qiáng)度高和熱穩(wěn)定性好等優(yōu)良特性而被廣泛用于酶固定化。朱偉教授團(tuán)隊(duì)長期致力于硅基基質(zhì)在酶固定化及調(diào)控生命體活動(dòng)等方面的研究，并取得了一系列成果（PNAS. 2024, 121, e2408273121; PNAS. 2024, 121, e2322418121; Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202406110；Nat. Rev. Bioeng. 2024, 2, 282; ACS Nano 2022, 16, 2164；Nat. Commun. 2022, 13, 6265；J. Am. Chem. Soc. 2021, 143, 17, 6305等）。
圖1.上圖：蛋白質(zhì)催化硅化反應(yīng)的示意圖，該過程原位強(qiáng)化固定化酶的結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)酶與載體材料間的相互作用。下圖：描繪固定化酶在三種不同硅化狀態(tài)下的催化活性和泄漏情況。
基于原位硅化法的“硅基無機(jī)膠水”具有以下幾大優(yōu)勢：
2）優(yōu)化酶與載體基質(zhì)的相互作用：多孔載體孔壁表面的官能團(tuán)（如氨基）能夠催化硅化反應(yīng)，隨后與發(fā)生硅化的酶相結(jié)合。這一過程如同 “膠水效應(yīng)”，極大地加強(qiáng)了酶與支持基質(zhì)之間的相互作用，有效防止酶泄漏，顯著延長固定化酶的循環(huán)壽命（圖3）。
圖3. a）EMG、EMGT-1和EMGT-2透射電子顯微鏡和部分放大。b） EMGT-1的 EDS 元件分析圖。c）EMG和EMGT-1的PXRD圖像。d）EMG和EMGT-1的77 K氮吸附等溫線。e）EMG和EMGT-1的孔徑分布曲線。f）EMG、EMGT-1和EMGT-2的回收穩(wěn)定性。在各種惡劣條件下處理后EMG、EMGT-1和EMGT-2的相對活性：g）5 M尿素。h）60 °C和 i） 凍融循環(huán)（從?80 °C 15分鐘到+35 °C 2 分鐘）。
為研究原位硅化對物理吸附法固定化酶體系的影響，研究人員通過調(diào)節(jié)硅烷濃度來研究硅化程度對固定化酶體系的影響，結(jié)果顯示40 mM硅化24 h的半固定狀態(tài)（EMGT-1）明顯提高葡萄糖氧化酶在介孔有機(jī)框架中的穩(wěn)定性和使用壽命，經(jīng)過8次循環(huán)后的剩余活性比僅固定化組提高44.51%。然而，80 mM硅化的24 h的全固定化狀態(tài)（EMGT-2）在循環(huán)使用測試過程中，酶活性均低于未硅化組EMG，猜測可能是由于過度硅化，導(dǎo)致多孔框架孔道縮小，進(jìn)而阻礙底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散。結(jié)果表明原位硅化過程是高度可控的，適當(dāng)?shù)墓杌梢约訌?qiáng)酶與基質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)固定化酶的循環(huán)能力和穩(wěn)定性（圖3）。
圖4. a）TLL 的圖和大小。b）EMT 和 EMTT 的回收穩(wěn)定性。在各種惡劣條件下處理后游離TLL、EMT和EMTT的相對活性：c）70 °C和d）凍融循環(huán)。e）PGA的圖和大小。f） EMP和EMPT的回收穩(wěn)定性。在各種惡劣條件下處理后游離PGA、EMP和EMPT的相對活性：g）50 °C和 h）凍融循環(huán)。i）GOx@Resin 圖。j）RG 和 RGT 的回收穩(wěn)定性。在各種惡劣條件下處理后游離GOx、RG 和 RGT 的相對活性：k）60 °C和l）凍融循環(huán)（從 -80 °C 15 分鐘到 +35 °C 2 分鐘）。
總得來說，基于原位硅化法的“硅基無機(jī)膠水”強(qiáng)化固定化酶體系的策略，從酶和載體的角度都證明其具有廣泛的適用性，有望為酶固定化領(lǐng)域引入一種新的技術(shù)，為具有成本效益的工業(yè)工藝開辟新道路，從而拓寬酶的應(yīng)用前景。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/adma.202407831
