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  細胞培養(yǎng)肉作為一種顛覆性的肉類生產(chǎn)技術(shù)，旨在通過體外大規(guī)模擴增并誘導(dǎo)分化肌肉干細胞以獲得與真實肉相似口感及營養(yǎng)價值的肉替代產(chǎn)品，具有綠色可持續(xù)、營養(yǎng)可控、環(huán)境污染小等優(yōu)勢，是未來食品的重要發(fā)展趨勢。該技術(shù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)之一在于可食用三維生物支架的開發(fā)。三維生物支架具有與細胞外基質(zhì)相似的微觀結(jié)構(gòu)，可為細胞黏附、增殖和分化提供指導(dǎo)，促進氧氣與營養(yǎng)物質(zhì)的交換。用于培養(yǎng)肉的支架材料應(yīng)是可食用和消化的、有良好的細胞親和性并能大規(guī)模和低成本獲得的。

  靜電場電流體噴射3D打印技術(shù)（EHDP）能夠制備微結(jié)構(gòu)可控的超細纖維支架，因其纖維尺寸與細胞大小相似，可以高度還原細胞外基質(zhì)環(huán)境，從而控制細胞的生長行為，被廣泛用于三維細胞培養(yǎng)與組織工程等領(lǐng)域。然而，由于該技術(shù)對打印墨水的性質(zhì)有很高的要求，目前尚可應(yīng)用的墨水材料十分有限且多為合成高分子材料，難以滿足制作細胞培養(yǎng)肉的基本需求，故制造可食用級的3D打印支架還需探索食品級墨水材料。

  近日，新加坡國立大學食品科學與工程系黃德建教授團隊首次以谷物醇溶蛋白（玉米、大麥和黑麥蛋白）為原料，成功制備具有合適流變性質(zhì)的純植物基墨水，并通過高精度3D打印技術(shù)制造了微結(jié)構(gòu)可控的谷物醇溶蛋白纖維支架，由此制備出具有組織相似性的細胞培養(yǎng)豬肉片原型，為細胞培養(yǎng)肉的生產(chǎn)提供了新思路。

圖1、 基于靜電場電流體噴射打印技術(shù)（EHDP）生產(chǎn)可食用醇溶蛋白支架及細胞培養(yǎng)肉的示意圖

  為獲取制備三維支架的原料，首先從谷物中提取出醇溶蛋白，包括玉米醇溶蛋白（zein）、黑麥醇溶蛋白（secalin）及大麥醇溶蛋白（hordein）。通過調(diào)整醇溶蛋白墨水濃度和不同醇溶蛋白的比例，獲得與EHDP技術(shù)常用的聚酯內(nèi)酯（PCL）墨水具有相似流變行為及電導(dǎo)性能的純植物蛋白墨水。在靜電場電流體噴射打印平臺上，通過實時監(jiān)測打印針頭噴射溶液的狀態(tài)，優(yōu)化打印條件（包括加載電壓、針頭-底板間距離、環(huán)境溫度和濕度等），從而獲得穩(wěn)定的噴射泰勒錐，形成連續(xù)沉積纖維。通過設(shè)計打印程序，EHDP技術(shù)可精確控制可食用谷物醇溶蛋白支架（zein/hordein及zein/secalin）的微觀結(jié)構(gòu)，包括纖維直徑、孔徑、孔隙、孔型和厚度等。通過掃描電鏡觀察到打印的谷物醇溶蛋白支架呈孔徑為400 μm的多層有序多孔結(jié)構(gòu)。在維持良好力學性能的同時，支架的孔隙率高達88%，其有利于細胞培養(yǎng)過程中的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及廢物運輸（圖2）。

圖2、 （A）zein/secalin支架實物圖；（B-D）zein/hordein、（E）zein/secalin、（F）PCL支架的SEM微觀結(jié)構(gòu)圖；（G-H） 醇溶蛋白支架的水合作用；（I）醇溶蛋白支架的力學性質(zhì)。

  為深入探究醇溶支架在細胞培養(yǎng)的應(yīng)用潛能，以骨骼肌細胞為模型，在支架上觀察細胞行為。研究發(fā)現(xiàn)，C2C12小鼠成肌細胞與豬骨骼肌衛(wèi)星細胞在醇溶蛋白支架上具有良好的黏附能力。經(jīng)過11天培養(yǎng)后，細胞數(shù)量分別擴增至30倍和10倍以上，通過共聚焦顯微成像可以觀察到細胞逐漸填滿支架的孔隙，表明支架良好的生物相容性。此外，區(qū)別于二維貼壁生長，三維支架上生長的骨骼肌細胞較為細長，具有與體內(nèi)肌肉組織更相似的微觀形貌（圖3）。

圖3、 （A）C2C12細胞和（B）豬骨骼肌衛(wèi)星細胞在PCL及醇溶蛋白支架上的增殖；（C）C2C12細胞和（D）豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的共聚焦熒光顯微成像圖；（E）2D平板和3D支架培養(yǎng)下細胞的形貌對比（藍色：DAPI，紅色：鬼筆環(huán)肽）。

  為誘導(dǎo)骨骼肌干細胞分化形成成熟肌管，在血清饑餓誘導(dǎo)7天后，C2C12成肌細胞的結(jié)蛋白（desmin）、肌細胞生成素（myogenin）及肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain）表達量顯著升高，標志成肌細胞的分化與成熟。有趣的是，在血清饑餓前，支架培養(yǎng)的細胞肌球蛋白重鏈蛋白的表達量已顯著高于二維培養(yǎng)，說明三維支架培養(yǎng)可加速成肌細胞分化。同時，在豬骨骼肌衛(wèi)星細胞的肌細胞生成素表達量也顯著提高，進一步表明干細胞在三維支架培養(yǎng)上的分化潛能（圖4）。

圖4、 （A）C2C12細胞和（B）豬骨骼肌衛(wèi)星細胞黏附相關(guān)基因的表達；（C）C2C12細胞和（D）豬骨骼肌衛(wèi)星細胞肌源調(diào)控因子的表達；（E）骨骼肌干細胞分化示意圖（藍色：DAPI，紅色：鬼筆環(huán)肽）。

  此外，醇溶蛋白支架具有良好的穩(wěn)定性，在培養(yǎng)細胞后，仍維持原有的微結(jié)構(gòu)。值得一提的是，在細胞培養(yǎng)一周后，蛋白纖維表面自發(fā)形成微孔結(jié)構(gòu)，說明體外降解性。作為概念性的驗證，通過在蛋白支架上連續(xù)培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化肌肉干細胞12天后，可以獲得直徑為2.5厘米的人造豬肉片。

圖5 （A）醇溶蛋白支架在PBS中浸泡7天、（B）培養(yǎng)肌肉細胞2天、（C-D）培養(yǎng)5天后的形貌圖；（E-F）人造肉模型。

  文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adma.202207397

  DOI: https://doi.org/10.1002/adma.202207397