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  以酶為代表的生物大分子在生物制造和生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域，具有重要且多樣的功能和應(yīng)用潛力。然而其通常以混合物的形式存在于天然生物系統(tǒng)中，濃度較低、成分復(fù)雜，容易受到操作過程和外界環(huán)境的影響。因此，從天然生物系統(tǒng)中高產(chǎn)率、高純度、高活性地提取目標(biāo)生物大分子（HHH純化）具有很大的挑戰(zhàn)，對(duì)高性能分離技術(shù)和介質(zhì)提出了迫切要求。

  南開大學(xué)陳瑤課題組創(chuàng)制了基于共價(jià)有機(jī)框架 (COFs)的“晶態(tài)海綿”，直接從天然生物系統(tǒng)（蛋清）中高效提取和生產(chǎn)特定酶。溶菌酶在食品、制藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，該研究將其設(shè)定為目標(biāo)酶。作者設(shè)計(jì)了溶菌酶相適配（孔道大小、親疏水性、表面電位等）的介孔COFs（TPB-DMTP-COF），通過可控的吸附和洗脫，成功地從雞蛋清中提取了高純度、高穩(wěn)定性、高活性的溶菌酶（圖1）。通過上述巧妙設(shè)計(jì)，可便捷地通過調(diào)節(jié)主客體相互作用獲得優(yōu)異的吸附選擇性，并實(shí)現(xiàn)對(duì)特定蛋白的捕獲和釋放。例如，負(fù)載在TPB-DMTP-COF的溶菌酶可以通過調(diào)節(jié)洗脫液的pH實(shí)現(xiàn)快速完全釋放。基于本方法從蛋清中直接提取的高純度溶菌酶展現(xiàn)出比商業(yè)化溶菌酶更高的活性（催化活性提高約3倍），且具有更高的穩(wěn)定性。值得注意的是，COF海綿表現(xiàn)出優(yōu)異的重復(fù)利用性：經(jīng)過5次高強(qiáng)度吸附-解析操作，效能無明顯降低。作者通過克級(jí)操作可以從雞蛋清中直接制備約0.7 克高純度溶菌酶，實(shí)現(xiàn)從天然生物系統(tǒng)直接高效精準(zhǔn)制備特定蛋白。

圖1. COF“晶態(tài)海綿”從蛋清中提取和制備高純度溶菌酶示意圖。

  作者對(duì)比了不同類型的分離介質(zhì)對(duì)溶菌酶的吸附能力，結(jié)果表明：TPB-DMTP-COF對(duì)溶菌酶的吸附能力（高達(dá)0.71g/g）遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的多孔材料（大孔樹脂、活性炭、MCM-41）。此外，COFs的種類、親疏水性、孔道大小和孔隙率等因素均會(huì)影響其對(duì)溶菌酶的吸附能力。通過激光共聚焦共定位進(jìn)一步確認(rèn)了TPB-DMTP-COF對(duì)溶菌酶優(yōu)異的負(fù)載能力，且蛋白在COFs中具有良好的分散性（圖2）。

  此外，作者進(jìn)一步分析了溶菌酶自身理化性質(zhì)（如等電點(diǎn)，pI~11），并以此為出發(fā)點(diǎn)設(shè)計(jì)并研究了不同pH下TPB-DMTP-COF電勢(shì)電位的變化規(guī)律，基于可逆質(zhì)子化機(jī)理，設(shè)計(jì)優(yōu)化了對(duì)溶菌酶的捕獲和釋放：當(dāng)pH高于7時(shí)，TPB-DMTP-COF材料和溶菌酶具有相反的電荷，TPB-DMTP-COF與溶菌酶之間的強(qiáng)靜電吸引促進(jìn)了對(duì)溶菌酶的吸附；當(dāng)pH調(diào)整到7以下時(shí)，酶與材料之間形成較強(qiáng)的的靜電斥力，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶菌酶的可控釋放（圖3）。

  作者將所設(shè)計(jì)的TPB-DMTP-COF體系運(yùn)用于從蛋清類天然生物系統(tǒng)中直接提取目標(biāo)蛋白。如SDS-PAGE所示，雞蛋清中含有多種不同分子量的蛋白質(zhì)（圖4a，Lane 1）。TPB-DMTP-COF處理后（圖4a，Lane 2）溶菌酶對(duì)應(yīng)的條帶消失，證明溶菌酶被TPB-DMTP-COF高效選擇性吸附。洗脫液顯示出與溶菌酶對(duì)應(yīng)的單一密集條帶(圖4a，Lane 3)，表明體系對(duì)溶菌酶的高效釋放，且所制備溶菌酶具有高純度。此外，與商業(yè)溶菌酶相比，所制備的高純度溶菌酶酶活提高到344%，并且對(duì)溫度、pH、有機(jī)溶劑處理，展現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。經(jīng)過5次吸附-解吸循環(huán)操作，TPB-DMTP-COF仍可從雞蛋清中高效提取出溶菌酶，表明該新型分離介質(zhì)具有優(yōu)良的重復(fù)利用性。上述從天然體系中便捷分離目標(biāo)蛋白的新方法，實(shí)現(xiàn)了高產(chǎn)率、高純度、高活性的HHH純化目標(biāo)。這項(xiàng)研究為高效生物分離的高性能多孔介質(zhì)設(shè)計(jì)提供了有價(jià)值的指導(dǎo)，并為蛋白類生物大分子的高純度便捷制備提出了創(chuàng)新思路。

  上述成果近期發(fā)表在Chem. Eng. J.上，通訊作者是南開大學(xué)陳瑤研究員，廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生陳海欣和南開大學(xué)藥學(xué)院博士生金超楠為共同第一作者。

作者團(tuán)隊(duì)簡介：

  陳瑤，南開大學(xué)藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、藥學(xué)院研究員，博士生導(dǎo)師。2016年加入南開大學(xué)，創(chuàng)建獨(dú)立課題組。研究長期聚焦生物大分子劑型工程及相關(guān)生物催化、生物分離的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。承擔(dān)多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目子課題和企業(yè)合作/委托項(xiàng)目。已發(fā)表論文87篇及中英文專著2部，以第一或通訊作者在包括Nat. Rev. Chem.，J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.，Chem, Adv. Mater.，Chem. Soc. Rev.，Coord. Chem. Rev.，ACS Central. Sci., ACS Appl. Mater. Inter.，J. Med. Chem. Adv. Healthc. Mater.等高水平學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文43篇（論文篇均影響因子>10），他引超過4000次，8篇論文入選ESI高被引。授權(quán)或申請(qǐng)中國發(fā)明專利31件、PCT2件、美國發(fā)明專利3件；任中國化工學(xué)會(huì)生物化工專委會(huì)常委、中國化工學(xué)會(huì)女科委首屆委員、中國生物醫(yī)藥技術(shù)協(xié)會(huì)生物制藥技術(shù)分會(huì)委員、天津市化工學(xué)會(huì)理事等，擔(dān)任CCL、Particuology、Biodesign Research等雜志編委；入選天津市高層次人才計(jì)劃，并獲得國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金。