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圖1 基于喹啉螺旋的人工質(zhì)子跨膜通道示意圖

  日前，杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院劉俊秋教授團隊在Nano Letters上發(fā)表題為“Unimolecular Helix-Based Transmembrane Nanochannel with a Smallest Luminal Cavity of 1 ? Expressing High Proton Selectivity and Transport Activity”的通訊研究論文。

  眾所周知，天然通道蛋白可以利用其獨特的過濾結(jié)構(gòu)實現(xiàn)對特定離子的高選擇性跨膜傳遞。例如，天然鉀離子通道KcsA是一種由四股螺旋組成的倒錐形結(jié)構(gòu)，其內(nèi)部最小尺寸為2.8 ?與鉀離子尺寸高度匹配，能夠有效的實現(xiàn)對鉀離子的高選擇性傳遞，并通過尺寸效應(yīng)阻止其它離子的跨膜傳輸。受此啟發(fā)，研究人員利用喹啉螺旋構(gòu)建了一種內(nèi)徑約為1 ?的單分子人工質(zhì)子跨膜通道，由于質(zhì)子的尺寸非常小，可以輕易地通過該納米孔道進行跨膜傳遞。而其它陰、陽離子以及水分子等由于具有較大的空間尺寸則被有效地排除在外（圖1）。理論分析表明，該喹啉螺旋的十六聚體（16mer）的高度約為2.5 nm，能夠以單分子形成嵌入磷脂膜的疏水層當(dāng)中并介導(dǎo)質(zhì)子的跨膜傳遞。而長度較短的四聚體（4mer）和八聚體（8mer）則沒有表現(xiàn)出明顯的質(zhì)子跨膜傳遞性能。以往的人工質(zhì)子通道通常是利用孔道內(nèi)連續(xù)的水線結(jié)構(gòu)實現(xiàn)質(zhì)子的跨膜傳遞，在這個過程當(dāng)中盡管可以排除其它離子的通過，但是卻無法阻止水分子的傳輸。而該基于人工螺旋的質(zhì)子通道內(nèi)徑僅有1 ?，可以同時將其它離子以及水分子排除在外，實現(xiàn)真正意義上的高選擇性質(zhì)子跨膜傳遞（圖2）。

圖2 喹啉螺旋的化學(xué)式與空間結(jié)構(gòu)

  隨后，研究人員又利用氫-氘交換核磁共振對該質(zhì)子通道的傳輸機理進行了詳細(xì)分析。首先采用溶解性更好的S-4mer作為研究對象，將其溶解到DMSO-d₆、CDCl₃和D₂O的混合溶劑當(dāng)中，向溶液中加入少量的氘代鹽酸（DCl·D₂O），然后監(jiān)測螺旋內(nèi)部活潑氫的變化。結(jié)果表明，螺旋空腔內(nèi)部與亞甲基相連NH_b上的H與氘代鹽酸中的D迅速發(fā)生交換，而NH_a上的氫原子的相對較為穩(wěn)定，隨后，從8mer和16mer的氫-氘交換實驗中也得到了相同的實驗結(jié)果。以上結(jié)果說明通道內(nèi)連續(xù)NH_b結(jié)構(gòu)在質(zhì)子跨膜傳遞過程當(dāng)中起到了關(guān)鍵的作用。溶液中水合的質(zhì)子通過與NH上的活潑氫進行交換，并利用磷脂膜兩側(cè)質(zhì)子濃度差為驅(qū)動快速實現(xiàn)選擇性跨膜傳遞（圖3）。

圖3 喹啉螺旋進行質(zhì)子傳遞的機理研究

  最后，利用單分子膜片鉗實驗對16mer的質(zhì)子傳遞性能進行深入分析，并采用天然的短桿菌肽A作為對照樣品（短桿菌肽A可以利用其內(nèi)部連續(xù)水線進行質(zhì)子跨膜傳遞）。研究表明在相同的條件下，16mer對質(zhì)子的跨膜傳輸速率達到驚人的10⁷ H⁺?s^-1?channel^-1與短桿菌肽A的質(zhì)子傳輸速率達到同一個數(shù)量級。然后通過在雙層膜的trans和cis室內(nèi)加入不同的電解質(zhì)溶液（NaCl、KCl、HCl）并在磷脂膜兩側(cè)施加不同的電壓測得其反轉(zhuǎn)電位（V_rev），利用該值以及Goldman-Hodgkin-Katz 方程可以計算出16mer通道分子對H⁺和Na⁺，K⁺，Cl^-的滲透選擇性比值分別為225.1, 74.8和99.6（圖4）。該基于喹啉螺旋的跨膜通道為迄今已知內(nèi)徑最小的人工納米孔道結(jié)構(gòu)。此外，該工作還發(fā)現(xiàn)了一種基于連續(xù)NH基團實現(xiàn)質(zhì)子跨膜傳輸?shù)男聶C制。該研究結(jié)果對于理解和模擬天然離子通道的傳輸行為具有重要的生物學(xué)意義，也為今后開發(fā)人工離子通道在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的潛在應(yīng)用提供了全新的思路。

圖4 人工質(zhì)子跨膜通道的膜片鉗單通道電流信號

  杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院博士后研究人員閆騰飛為論文的第一作者，通訊作者為青年教師孫鴻程博士、于雙江特聘教授和劉俊秋教授。該研究工作得到了國家科技部重點研發(fā)計劃項目（2020YFA0908500, 2018YFA0901600）和國家自然科學(xué)基金（22001054, 22075065）的支持。

  論文連接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.1c03858