欧美日韩Aa在线直播_自拍青草99视频_日本一线产区和韩国二线_日韩.国产.噢美日韩精品综合观看_亚州四虎精品久久久_曰曰日在线_精品久久久av_精品欧美国产一区二区三区不卡_欧美亚洲日韩_天天ri网_国产精品看片直播_亚洲中文久久久久久精品国产_天天色天天日综合_久久久久久成人免费看A四叶草_丁香六月狠狠综合天香_永久的伊甸园_国产熟妇无码A片AAA毛片视频

  基于微流控液滴的單細(xì)胞測(cè)序方法因其極高的通量和單細(xì)胞的靈敏度而引發(fā)了生物學(xué)的一次革命。在微流控單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)中，DNA編碼微球是其核心。目前常見(jiàn)的用于高通量單細(xì)胞測(cè)序的DNA編碼微球分別為在inDrop技術(shù)、Drop-seq技術(shù)和10X Genomics公司測(cè)序技術(shù)中使用的微球。這些微球各有其優(yōu)缺點(diǎn)：inDrop技術(shù)中的條形碼微球由于能夠緊密堆積從而能夠在液滴中高效負(fù)載，但其合成所需的引物價(jià)格昂貴且需要引入對(duì)細(xì)胞和核酸有影響的紫外光；Drop-seq技術(shù)中的條形碼微球因反應(yīng)過(guò)程集中在微球表面而降低總體反應(yīng)效率；10X Genomics公司測(cè)序技術(shù)中的DNA編碼微球價(jià)格昂貴且DNA編碼引物不能靈活調(diào)節(jié)。因此，如何發(fā)展一種新的易制備、易操作、造價(jià)低、效率高的DNA編碼微球是高通量單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)中的一個(gè)難題。

  David Weitz教授課題組報(bào)道了一種可控降解的聚丙烯酰胺條形碼微球的制備方法。該微球能夠在DTT（二硫蘇糖醇，一種與多數(shù)生物化學(xué)體系兼容的常見(jiàn)的還原劑）存在下快速發(fā)生降解，并將微球上的DNA釋放到液滴中。該可控降解型聚丙烯酰胺凝膠條形碼微球容易制備、容易降解、制作成本低、反應(yīng)效率高、條形碼設(shè)計(jì)靈活且能夠在液滴包裹中實(shí)現(xiàn)緊密堆積而提高液滴使用率。

圖1. (A) 可控降解型聚丙烯酰胺微球的合成和降解原理示意圖，(B)可控降解型微球在基于液滴的單細(xì)胞分析過(guò)程使用的圖示。

  該團(tuán)隊(duì)使用微流控設(shè)備首先制備了該可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球，并探究了在DTT存在下的降解情況。實(shí)驗(yàn)證明直徑為80 μm左右的微球在1 mM DTT存在下能夠在3 min中完全降解，在10 mM DTT存在下能夠在30 s內(nèi)完全降解。聚丙烯酰胺凝膠微球降解后能夠?qū)⑽⑶蛏系囊镝尫诺饺芤褐惺蛊溆行У剡M(jìn)行后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，同時(shí)，降解后的產(chǎn)物并不會(huì)引起溶液物理性質(zhì)，如粘度等的變化。

圖2. (A) 微球在不同DTT濃度下的降解時(shí)間，(B)在1 mM DTT存在下0, 60, 120,以及180 s時(shí)微球在顯微鏡下的狀態(tài)，(C)在1 mM DTT存在下0, 60, 120,以及180 s時(shí)標(biāo)記上熒光后的微球的熒光圖像，(D)隨機(jī)選擇8個(gè)微球的熒光強(qiáng)度在降解過(guò)程中隨時(shí)間的變化情況。

  在此基礎(chǔ)上，該團(tuán)隊(duì)將可控降解型聚丙烯酰胺凝膠微球用于高通量液滴中單細(xì)胞的RNA和蛋白表達(dá)分析中。首先，將單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)標(biāo)記上目標(biāo)基因引物序列的可降解型聚丙烯酰胺凝膠通過(guò)微流控技術(shù)包裹在單個(gè)液滴中，微球在DTT存在下降解后，將引物釋放到液滴里，去捕獲細(xì)胞裂解后的mRNA。以GAPDH和TCRA的mRNA為例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，該方法能夠有效的捕獲細(xì)胞中的目標(biāo)mRNA，如下圖3所示。同時(shí)，若將編碼DNA和細(xì)胞表面蛋白的抗體偶聯(lián)并預(yù)先與細(xì)胞溫育，則該可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球還可以應(yīng)用在單細(xì)胞的細(xì)胞表面蛋白，如CD3的表達(dá)分析中。在單細(xì)胞的RNA測(cè)序和蛋白表達(dá)分析中，可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球不會(huì)對(duì)后續(xù)的生物化學(xué)反應(yīng)造成影響，能夠有效地實(shí)現(xiàn)其條形碼引物釋放的功能，并呈現(xiàn)出獨(dú)特的功能優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，可降解型聚丙烯酰胺凝膠微球作為新的高通量單細(xì)胞測(cè)序分析中使用的工具，改善了傳統(tǒng)的條形碼微球的制備方案，能夠有效促進(jìn)高通量單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展。

圖3. (A)顯微鏡下包裹單個(gè)細(xì)胞和單個(gè)微球的液滴的產(chǎn)生過(guò)程，(B) TCRA和GAPDH mRNA的qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(C) GAPDH和TCRA mRNA在液滴中反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(D)抗體–DNA偶聯(lián)物結(jié)合細(xì)胞表面蛋白的示意圖，(E)單細(xì)胞表面蛋白分析中的qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，(F)細(xì)胞表面蛋白分析中的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  以上相關(guān)實(shí)驗(yàn)成果發(fā)表在Advanced Science雜志上（Adv. Sci. 2020, 1903463）。論文的第一作者兼通訊作者為哈佛大學(xué)博士生Yongcheng Wang，共同第一作者為北京大學(xué)博士生Ting Cao，共同通訊作者為哈佛醫(yī)學(xué)院的Ralph Weissleder教授和哈佛工學(xué)院的David Weitz教授。

  論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/advs.201903463